Antiniotika und Toxine in Lebensmitteln
Um pharmakologisch wirksame Substanzen in tierischen Lebensmitteln zu bestimmen, werden in Überwachungs- und Handelslaboratorien nahezu flächendeckend Gas- und Flüssigchromatographen in Kopplung mit Massenspektrometern verwendet (GC/MS/MS und LC/MS/MS). Die Vorteile liegen auf der Hand: eine hochselektive Quantifizierung über einen breiten Konzentrationsbereich, die simultane Erfassung einer Vielzahl von Verbindungen, die schnelle softwarebasierte Auswertung vieler Proben und die Automatisierbarkeit von Messung und Auswertung.
Um bei der Analyse von Tierarzneimittelrückständen eine hohe Sensitivität und Wiederholbarkeit zu gewährleisten, schließen Probenvorbereitungen eine Aufreinigung mittels Festphasenextraktion (SPE) ein. Als Alternative zu solchen Probenvorbereitungen wird die QuEChERS-Methode ohne dispersive SPE verwendet (Abb. 1, [1]). Hiermit werden für 90% der untersuchten Verbindungen Wiederfindungen zwischen 70 und 120% erzielt. Für die Bestimmung wurden die Extrakte der untersuchten Matrices mit 10µg/l je Analyt gespiked (Abb. 2). Wird der Standard unmittelbar vor der Extraktion zugegeben, erhält man die Wiederfindungen in Tabelle 1. Für sehr polare Verbindungen wie z.B. Tetrazykline und Chinolone werden niedrige Wiederfindungen erzielt. Diese kann durch Anpassen des Extraktionsmittels erhöht werden.
Verbesserung der Peakform durch Koinjektion von Wasser
Die Direktinjektion der Acetonitrilphase kann in der Umkehrphasen-Chromatographie zur Elution als Doppelpeak führen. Um dieses Problem bei der Analyse zu umgehen, wird die Pretreatment-Funktion des Shimadzu Autosamplers SIL-30A genutzt, um 2µl der Lösung mit 10µl Wasser auf die Säule zu injizieren [2]. An dieser Stelle bietet sich die Möglichkeit, automatische Verdünnungs- und Pipettierschritte einzubauen.
In einem 14-minütigen chromatographischen Lauf werden alle 89 Verbindungen der Methode als scharfe Peaks abgebildet. Wie bei LC/MS/MS-Multimethoden üblich, werden nicht alle Peaks getrennt und pro Verbindung zwei MRMs gemessen. Hinzu kommt, dass einige Analyten im positiven und andere im negativen ESI-Modus ionisiert werden. Mit 5ms Polaritätswechselzeit und einer minimalen Dwell Time von 0,8ms bei gleichbleibender Signalintensität erhält man mit dem LCMS-8050 trotz Koelution viele Datenpunkte pro Peak (UFMS, Ultra Fast Mass Spectrometry).
Empfindlichkeit und Robustheit
Durch den Verzicht auf die dispersive SPE könnte man erwarten, dass der Effekt der Probenmatrix auf die Empfindlichkeit und Robustheit des LCMS-8050 deutlich höher ist, aber das Gegenteil ist der Fall: Alle 89 Verbindungen sind in den getesteten Matrix-Extrakten Huhn, Schwein, Lachs und Shrimps mit unteren Bestimmungsgrenzen bis herab zu 0,01µg/l quantifizierbar. Trennt man die Matrix nicht ab, können Matrixbestandteile als Neutralteilchen in das Massenspektrometer gelangen und sich dort an der Ionenoptik ablagern – das kann zu Empfindlichkeitseinbußen führen. Mitentscheidend für eine lange Standzeit des Detektors ist daher die Gasmenge, die in das Vakuum gelangt. Durch den vergleichsweise kleinen Ioneneinlass wird sie minimiert und damit die Standzeit erhöht. Dennoch ist eine hohe Sensitivität durch effiziente Fokussierung und Fragmentierung der Ionen gewährleistet. Die Robustheit der Methode wurde anhand von 220 Folgeinjektionen von Schweinextrakt, der mit 10µg/l Analytmix gespiked wurde, gezeigt. Die Chromatogramme der ersten und der 220. Injektion sind vergleichbar: Die Peakflächen bleiben über alle Injektionen mit einer relativen Standardabweichung von 1,5–3,5% (n = 220) konstant.
Auch in der Mykotoxinanalytik werden zunehmend LC/MS/MS-Multimethoden angewendet. Je nach Toxin und Lebensmittel gibt es in der EU unterschiedliche Höchstgehalte – besonders niedrig sind diese in Nahrungsmitteln für Säuglinge und Kleinkinder.
Abb.1 Schnelle Probenvorbereitung für die Bestimmung von Tierarzneimittelrückständen. *QuEChERS Extraction Salts Kit: Restek Q-sepTM AOAC2007.01
Tab.1 Wiederfindungen von verschiedenen Tierarzneimittelrückständen in Lösemittel und Matrix
Hochdurchsatz statt Matrixkalibrierung
Nur bestimmte Mykotoxine bilden sich abhängig vom Lebensmittel und dessen Lagerung. Daher sind analyt- und lebensmittelspezifische Einzelmethoden zielführend, erschweren aber einen hohen Probendurchsatz. Speziell für die Messung einer Vielzahl an Proben wurde eine sensitive LC/MS/MS-Methode mit dem LCMS-8050 entwickelt. Hier werden 45 Mykotoxine in einem chromatographischen Lauf von nur 11 min gemessen, sodass die Bestimmung unabhängig vom Probenmaterial immer dieselbe ist.
Tab.2 MRM-Chromatogramm von 89 Tierarzneimitteln (10?pg/µl Schweinextrakt mit internem Standard)
Obwohl eine Analytik ohne Probenaufreinigung die geforderte Sensitivität bieten kann, sind Kalibrationen in der Matrix erforderlich, um den Effekt des jeweiligen Lebensmittels auf das Messsignal zu berücksichtigen und korrekte Ergebnisse zu erhalten. Hier werden alle 45 Mykotoxine mit einer SPE-Methode von den getesteten Matrices abgetrennt. So ist es möglich, verschiedene Proben z.B. Babymilchpulver, Mehl, Reis oder Tapioka mit einer Kalibrierung in Lösemittel zu quantifizieren und einen hohen Probendurchsatz zu erreichen. Diese Methode geht nicht zu Lasten der Qualität: Die Wiederfindungen liegen z.B. bei den Aflatoxinen bei fast 100%. Im ersten Schritt werden 5g Probenmaterial eingewogen, mit 20?ml Wasser/Acetonitril 1/1 (v/v) versetzt und 5min im Ultraschallbad beschallt. Anschließend wird 30?min lang bei Raumtemperatur geschüttelt und 10 min mit 3.000g zentrifugiert. Der Überstand wird eins zu vier mit Wasser verdünnt. Nachdem die SPE-Kartusche (Isolute® Myco, 60mg/3ml, Biotage, Schweden) mit 2 ml Acetonitril und dann mit 2ml Wasser konditioniert wurde, wird diese mit 3ml verdünntem Überstand bei niedrigstem Fluss beladen. Erst wird mit 3 ml Wasser, dann mit 3ml Wasser/Acetonitril 9/1 (v/v) gespült. Nach dem Trocknen wird mit 2 ml Acetonitril + 0,1% Ameisensäure und dann mit 2 ml Methanol eluiert. Das Eluat wird bis zur Trockne eingeengt (Turbovap, Biotage, Schweden), mit 150µl Wasser/Methanol/Acetonitril 80/10/10 (v/v/v) + 0,1% Ameisensäure rekonstituiert und 10µl injiziert.
Abb. 2 Wiederfindungen aller Tierarzneimittel in jeder Matrix
Nützliche Werkzeuge gegen Carryover
Kritisch bei Fumonisinen ist die Komplexbildung mit Metallionen an Edelstahloberflächen und die damit verbundene Verschleppung (Carryover). Daher wird hier eine analytische Säule verwendet, die innen mit PEEK beschichtet ist. Fumonisine, die an der Metalloberfläche der Injektionsnadel haften, können über die Spülfunktion der SIL-30-Autosampler mit bis zu drei Lösemitteln während der Laufzeit des Chromatogramms entfernt werden [3].
Nachdem Proben gemessen wurden, muss eine Vielzahl von Analyten ausgewertet werden. Genau für diese Anforderungen bei GC/MS/MS-Analysen ist die LabSolutions Insight entwickelt worden, die eine schnelle visuelle und rechnerische Auswertung großer Datenmengen ermöglicht. Alle MRM-Chromatogramme einer Probe können auf dem Bildschirm dargestellt werden – für ein schnelles visuelles Screening. Weitere Features sind die einfache Ergebnisreportausgabe und Flags zur Markierung einer Probe, wenn z.B. eine analytspezifische Konzentrationsobergrenze überschritten wurde.
Literatur
[1] Levi, M.& Moreau, S. (2014) ASMS, Poster MP 345
[2] Sanchez, A.C. et al. (2012) J. Chromatogr. A 1228, 338–348
[3] Tamura, M. et al. (2013) ASMS, Poster TP37-739
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