Bio&Biotech > Enzymatik – der Weg in die Mikrotiterplatte

Enzymatik – der Weg in die Mikrotiterplatte

Süßes oder Saures

von Tobias Hein

LakÄhnlich wie die im Beitrag in labor&more 6, 2012, S. 38–40, beschriebene mikrobiologische Vitaminanalytik reicht auch die enzymatische Untersuchung von Lebensmitteln bis weit in das vergangene Jahrhundert zurück. Die vielfältigen Methoden zur Bestimmung von Zuckern, Säuren und anderen Metaboliten wie Ethanol gehören bis heute zum Grundrepertoire jedes lebensmittelchemischen Labors. Traditionell basierte die Analytik dabei auf Einzelmessungen, die in Küvetten durchgeführt wurden. Durch die Einführung der Mikrotiterplatte lässt sich nun auch die Enzymatik in der Handhabung vereinfachen und wirtschaftlicher gestalten.

Unter dem Begriff „Zucker“ werden im Rahmen der Lebensmittelinformationsverordnung (EU) Nr. 1169/2011 alle Monound Disaccharide, ausgenommen mehrwertige Alkohole, zusammengefasst. Abseits dieser Definition ist es auch bei Oligosacchariden wie der aus Saccharose und Galaktose zusammengesetzten Raffinose durchaus üblich, von Mehrfachzuckern zu sprechen. Der bekannten Vielzahl von Zuckern standen in der Geschichte der Lebensmittelchemie jedoch lange Zeit nur unspezifische Analysenmethoden gegenüber. So war die analytisch relevante Eigenschaft von Zuckern ihre Fähigkeit, Schwermetalle wie z. B. Kupfer zu reduzieren. Erstmals veröffentlichte Hermann Christian von Fehling auf dieser Grundlage Mitte des 19. Jahrhunderts eine Methode zur Quantifizierung von Zucker im Harn [1]. Einer blau gefärbten Kupfer-Tartrat-Komplexlösung wurde die zu untersuchende Probe zugesetzt. Kam es beim Erhitzen zur Reduktion der Kupfer(II)-Ionen zu Kupfer(I)- Ionen, erfolgten ein Farbumschlag und die Ausfällung in Form von rotbraunem Niederschlag. Auf einem ähnlichen Prinzip basiert die Zuckerbestimmung nach Luff-Schoorl, wobei der nach der Reduktion im Ansatz verbleibende Überschuss an nicht reduzierten Kupfer(II)-Ionen iodometrisch bestimmt wird [2]. Von der verbrauchten Kupfermenge konnte so zwar auf die Menge des an der Reaktion beteiligten reduzierenden Zuckers geschlossen werden. Da jedoch kein linearer Zusammenhang bestand, war es sowohl bei Luff-Schoorl als auch bei Fehling nötig, den Zuckergehalt aus einer empirisch aufgenommenen Wertetabelle abzulesen. Die genannten Methoden erfassten alle reduzierenden (also eine Halbacetalstruktur enthaltenden) Zucker. Als nicht reduzierender Stoff ließ sich hingegen z. B. Saccharose nicht direkt nachweisen, sondern musste vorab durch Säurehydrolyse in die reduzierenden Monosaccharide Glukose und Fruktose gespalten werden.

Süßes oder Saures? Eine Frage für die Enzymatik

In der Routineanalytik wurden die aufwändigen und unspezifischen reduktometrischen Verfahren schließlich von enzymatischen Methoden verdrängt, die darüber hinaus eine lineare Quantifizierung erlauben. Mittels spezifischer Enzyme ist es nicht nur möglich, die verschiedenen Zuckerarten getrennt zu bestimmen, sondern auch eine Vielzahl verschiedener organischer Säuren und anderer Metabolite. Ähnlich wie die mikrobiologische Vitaminanalytik (siehe l&m 2012, 6) reicht auch die enzymatische Untersuchung bis weit in das vergangene Jahrhundert zurück. Eine entsprechende Methode zur Bestimmung von Glukose und Fruktose war z. B. bereits 1961 bekannt [3]. Die Spannweite der enzymatischen Verfahren ist enorm: Sie reicht vom Allerweltszucker Saccharose über Laktose und Sulfit, beides Auslöser von Nahrungsmittelunverträglichkeiten, bis hin zu nicht nur in der Getränkeindustrie weit verbreiteten Substanzen wie Ethanol und Citronensäure. Nebenbei schließt die Enzymatik auch noch eine Lücke der Vitaminanalytik: Sie ermöglicht den Nachweis von Ascorbinsäure (Vitamin C), dem einzigen wasserlöslichen Vitamin, das sich nicht mikrobiologisch bestimmen lässt. Durch die außerordentliche Selektivität der Enzyme sind die Verfahren hochspezifisch und gestatten eine sehr sensitive Bestimmung des Analyten. Enzymatische Tests haben daher in der Lebensmittelchemie bis heute einen festen Platz. Allen Methoden gemein ist die Verwendung spezieller Enzyme, die die zu bestimmende Substanz spalten und/oder an Redoxreaktionen beteiligt sind, in deren Folge die eigentliche Messgröße entsteht. Diese bewirkt schließlich einen Farbumschlag oder eine Veränderung des Absorptionsverhaltens im ultravioletten Bereich.

Klassisch mit Küvette

Die Enzymatik ist seit Langem Bestandteil offizieller Methodensammlungen. So stammen bspw. die in der Amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB beschriebenen Verfahren zur Bestimmung von Laktose bzw. Saccharose in Fleischerzeugnissen aus dem Jahr 1983 [4, 5]. Entsprechende kommerzielle Kits für die Routineanalytik von Lebensmitteln basieren auf einem seit Jahrzehnten unveränderten Prinzip, bei dem Einzelmessungen nacheinander in Küvetten durchgeführt werden. Auch wenn den verschiedenen Methoden unterschiedliche Reaktionsmechanismen zu Grunde liegen, lässt sich das Grundprinzip an der Bestimmung von Laktose/ Galaktose veranschaulichen: Es werden für jede Probe zwei Ansätze durchgeführt: Im einen (grün) wird nur die freie Galaktose in der Probe bestimmt, im anderen (blau) wird zuvor die Laktose mit ?-Galaktosidase verdaut, um zusätzlich zur freien auch die in der Laktose gebundene Galaktose zu erfassen. Jeweils vor und nach der Reaktion (2) erfolgt die fotometrische Messung. Das gebildete NADH lässt sich so über die Zunahme der Extinktion (?E = E2 – E1 – ?E des Leerwertes) bestimmen und ist der Galaktosekonzentration direkt proportional. Traditionell wird unter Berücksichtigung des Reaktions- und Probenvolumens, der molaren Masse des Analyten, des spezifischen Extinktionskoeffizienten und der Küvettenschichtdicke auf den Galaktosegehalt in g/100 g umgerechnet. Aus der Differenz beider Ansätze wird auf die gebundene Galaktose geschlossen und von dieser auf Laktose umgerechnet. Da für jede Probe eine neue Küvette und zusätzlich ein Spatel benötigt wird, mit dem der Reaktionsansatz durch Rühren von Hand gemischt werden muss, ist diese Verfahrensweise besonders bei mittleren bis hohen Probenzahlen sehr arbeitsaufwändig und mit hohem Materialverbrauch verbunden. Hinzu kommt, dass vor der ersten Messung die Reaktionsansätze in allen Küvetten mit Wasser auf ein einheitliches Volumen eingestellt werden müssen. Konkret bedeutet das: Die Pipette muss je nach Küvetteninhalt beim selben Pipettierschritt mehrfach umgestellt werden, z. B. von x ml für den Laktose-Leerwert auf x – 0,1 ml für die Laktoseprobe, auf x + 0,05 ml für den Galaktose- Leerwert und auf x – 0,05 ml für die Galaktose-Probe.

Küvetten gehören der Vergangenheit an

Wie bereits bei der Vitaminanalytik zeigte sich also auch in der Enzymatik Bedarf an einem Kitformat, das die bewährten Methoden in die Mikrotiterplatte überträgt. So begann das ifp im Jahr 2011 mit der Arbeit an der neuen Produktlinie EnzymeFast®, die speziell für die Durchführung in der Mikrotiterplatte entwickelt wurde. Die Mikrotiterplatte ist bereits in allen Test- Kits enthalten. Der Zukauf von Einmalküvetten erübrigt sich damit, und auch der Rührspatel hat ausgedient – anstatt nach jedem Pipettierschritt der Reihe nach alle Proben von Hand umzurühren, wird der Reaktionsansatz direkt beim Pipettieren durch einfaches Auf- und Abziehen mit der Pipettenspitze gemischt. Die Pipettier volumina sind außerdem für Leerwerte, Standards, Kontrollen und Proben stets einheitlich. Analytisch unterscheidet sich das Mikrotiterplatten- Kit durch die Quantifizierung mittels eines im Kit enthaltenen Standards. Anhand der ermittelten Kalibriergeraden und des Probenverdünnungsfaktors F lässt sich die Konzentration des Analyten in der Probe wie folgt berechnen:

Galaktosegehalt [g/100 g (ml)] = (?E-Probe - y-Achsenabschnitt) x F / Steigung x Probeneinwaage [g(ml)]

Die Extinktion wird bei allen Proben parallel im UV/Vis-Mikrotiterplattenfotometer (ELISA-Reader) gemessen, je nach Para meter bei 340 – 570 nm. Für die Auswertung werden die exportierten Rohdaten einfach über Excel in die Auswertevorlage kopiert, wo das Endergebnis nach Eingabe von Verdünnungsfaktor und Einwaage automatisch berechnet wird. Liegen bereits umfangreiche Erfahrungen mit einer größeren Anzahl von Kalibrierungen vor, kann in der Gleichung auch der Mittelwert der Steigungen oder alter nativ die auf dem Quality Assurance Certificate angegebene Steigung verwendet werden. In diesem Fall entfällt die Kalibrierung. Zur Überprüfung der so berechneten Werte sollte stets die Kontrolllösung mitgeführt werden, die ebenfalls im Kit enthalten ist. Die Vergleichbarkeit der mit herkömmlichen Küvettenkits und den enzymatischen Test-Kits ermittelten Ergebnisse konnte in umfangreichen Validierungen gezeigt werden. Ein Auszug der Daten ist Tabelle 1 zu entnehmen.

Ausblick

Die anfangs erhältlichen Methoden, die weltweit über eine exklusive Kooperation zwischen Romer Labs und ifp vertrieben werden, umfassen das ganze Spektrum der Zuckeranalytik: Laktose/D-Galaktose,Laktose/D-Glukose, Saccharose/ D-Glukose/D-Fruktose, Saccha rose/ D-Glukose, D-Glukose/D-Fruktose, Raffinose/D-Ga la ktose, Maltose/Saccharose/D-Glukose. Weitere Parameter wie Ethanol, D-Sorbit/Xylit und verschiedene organische Säuren sind in der Entwicklung.

Literatur
[1] Fehling, H.C. (1848) Quantitative Bestimmung des Zuckers im Harn, Archiv für physiologische Heilkunde, 7, 64-73. [2] BVL L 31.00-11 (1984): Bestimmung des Zuckergehaltes vor und nach Inversion in Fruchtsäften (Luff-Schoorl-Methode), 11- 1983, Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB. [3] Schmidt, F.H. (1961) Die enzymatische Bestimmung von Glucose und Fructose nebeneinander, Klinische Wochenschrift 39, 1244-1247. [4] BVL L 07.00-23 (1983): Bestimmung von Lactose in Fleischerzeugnissen, 05-1983, Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB. [5] BVL L 07.00-24 (1983): Bestimmung von Saccharose in Fleischerzeugnissen, 05-1983, Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB.