Funktionelle Nanopartikel

Von Fetttröpfchen in Pflanzenzellen zu neuartigen Lebensmitteln

von Dr. Birgitta Zielbauer, Prof. Dr. Behic Mert, Prof. Dr. Thomas Vilgis

Oleosome sind natürliche, in Ölsaaten vorkommende ­Partikel mit besonderen Eigenschaften. Ihre sorten­spezifische Größe reicht von Mikro­metern bis in den ­Nanometerbereich hinein. Diese Partikel mit protein­funktionalisierter ­Ober­fläche sind aufgrund ihres Aufbaus extrem stabil. Damit sind sie für Grund­lagenforschung, ­die Pharma­kologie und auch für innovative Anwendungen im Lebensmittelbereich relevant.

Pflanzliches Fett: Ölsaaten und Ölpflanzen

Was haben Mais, Sojabohne, Sesam, Palmen, Sonnenblume, Oliven, Erdnuss und Kürbis ­gemeinsam? Sie alle sind „Ölfrüchte“ im landwirtschaftlichen Sprachgebrauch und seit Jahrhunderten Quelle für pflanzliches Öl, welches – je nach Zusammensetzung seiner Fettsäuren – die unterschiedlichsten Zwecke in der Küche erfüllt. Im botanischen Sprachgebrauch wird noch unterschieden zwischen der Frucht bzw. dem Fruchtfleisch (Oliven, Palmen) und den Samen oder Saaten, je nachdem, aus welchen pflanzlichen Geweben das Öl isoliert wird. Außerhalb des bota­nischen Interesses war bislang wenig bekannt, wo, weshalb und wie Pflanzen Öl speichern. ­Besonders gut erforscht sind diese Ölreservoire bei den Ölsaaten wie Mais, Sonnenblumenkernen oder Sojabohnen. Sie werden als „Ölkörper“ (aus der angelsächsischen Fachliteratur: Oil bodies) oder Oleosome bezeichnet (Abb.1). Deren besseres Verständnis kann erklären, welche Anstrengungen vonseiten der Ölproduzenten unternommen werden müssen, um das Öl aus dem Ölsamen zu extrahieren, aber auch grundlegende Erkenntnisse über Funktion und Wechselwirkung von Phospholipiden mit Proteinen liefern. Die typische Größe der Oleosomen im Nanobereich (in Sojabohnen ca. 300?nm Durchmesser) ist für die Keimung und das Wachstum des Samens essenziell. Zur Zeit der Keimung, in der die Pflanze noch keine Photosynthese betreiben kann, werden die gespeicherten Neutralfette mithilfe von Enzymen zu freien Fettsäuren und schließlich Monosacchariden abgebaut, die für den Aufbau von Kohlenhydraten benötigt werden [1]. Da ein geringes Volumen zu einer vergrößerten Gesamt­oberfläche führt, bieten die Oleosome den fettverdauenden Enzymen (Lipasen) eine größere Angriffsfläche. Dies ist wichtig, um in der kurzen Zeit der Keimung möglichst viel Energie für das Wachstum des Keimlings zur Verfügung zu stellen.

Für die Biosynthese von Fetten bedienen sich Pflanzen ihrer großen Vielfalt an Organ­ellen (Zellorganen) und deren Enzymapparat. Die ­Biosynthese der Fettsäuren läuft ausschließlich in den Plastiden ab – am bekanntesten sind die grünen Chloroplasten. Diese stammen nach der Endosymbiontentheorie von Cyanobakterien ab. Deswegen sind ihre Fettsäure aufbauenden ­Enzyme prokaryotischen Ursprungs (stammen von Bakterien ab). Dies ist der Grund, weshalb Pflanzen Fettsäuren herstellen können, die für den Menschen essenziell sind, welche er also nicht selbst herstellen kann. Dazu nützt die Pflanze Enzyme, etwa die -1,2-Desaturase. ­Dieses Enzym desaturiert, es baut Kohlenstoffdoppelbindungen in die Fettsäuren ein: Aus gesättigten Fettsäuren ­werden ungesättigte, etwa die essenziellen Fettsäuren Linolsäure (zweifach ungesättigt) und Linolensäure (dreifach ungesättigt). Ungesättigte Fettsäuren stellen die Pflanzen nicht zwangsläufig zum Wohl der Konsumenten oder Ökotrophologen her, sondern sie spielen eine wichtige Rolle bei der Einstellung von Kältetoleranz bei Pflanzen. Diese Fettsäuren bleiben auch bei niedrigen Temperaturen wegen ihres niedrigen Schmelzpunkts flüssig. Kältetolerante Pflanzen lagern mehr Phospholipide mit ungesättigten Fettsäuren in ihre Zellmembran ein und erhöhen somit deren Fluidität (und erniedrigen ihre Kristallisationstemperatur). Ganz anders bei Tropenpflanzen wie Kokosnüssen. Dort werden wegen der leichten Oxidation der ungesättigten Fettsäuren eher gesättigte Fettsäuren eingebaut und der Schmelzpunkt wird lediglich über die Kettenlänge gesteuert. Kokosfett ist daher ein stark gesättigtes Fett, allerdings mit kurzen Fettsäuren.

Aufgrund von Erkenntnissen aus der Pflanzen­physiologie und Zell­biologie ist inzwischen ­bekannt, wie Pflanzen es schaffen, Öl in einer Pflanzen­zelle in sehr kleine Fetttröpfchen (den Oleosomen) zu verteilen bzw. zu emulgieren. In der Pflanzenzelle findet quasi ein Emulgations­prozess auf Nanoebene statt, der von der Evolution über Jahrmillionen optimiert wurde. An einem spezialisierten Zellorganell (dem endoplasmatischen Retikulum) sammeln sich innerhalb seiner Membran (also zwischen der Phospholipiddoppelschicht) die von den Enzymen her­gestellten fertigen Fette. Dies führt zu Ausstülpung der Membran zu kleinen Tröpfchen, die sich aus der Membran abschnüren können [2]. Die Größe des Tröpfchens wird durch die erwähnten Oleosin-Proteine vorgegeben, welche sich gleichzeitig in das nun entstehende Oleo­som einlagern.

Oleosine: besondere Proteine

Diese Proteine, die die einzelnen Oleosome stabilisieren, sind einzigartig in ihrer Form und Funktion. Naiv kann man sich ein Oleosin wie einen „Regenschirm“ vorstellen. Der äußere Schirmteil ragt ins Wasser, ist ­damit hydrophil und der Stock ist im Öl verankert, also hydrophob ­(siehe Abb.1). Genau diese starke Verankerung im Öl macht die Oleosine extrem stabil, sie besteht aus einer ca. 70 Aminosäuren langen Sequenz aus hydrophoben Aminosäuren, die eine sogenannte Haarnadelstruktur bildet. Diese Sequenz ist die längste in der ­Natur bekannte hydrophobe Aminosäure­sequenz [2]. Ein weiteres Erkennungsmerkmal der Oleosine ist der „Prolinknopf“, der drei Proline (eine als „Strukturbrecher“ bekannte Amino­säure) enthält und die knopfartige 180°-Drehung der Haarnadel bildet. Diese mittlere hydrophobe Sequenz der Oleosine ist bei allen Pflanzensamen identisch. Unterschiedlich hingegen sind lediglich die Randsequenzen, die hydrophilen Schirme der Oleosine, die sogenannten N-terminalen und ­C-terminalen Teil­bereiche. Sie können aus ­verschiedenen hydrophilen Domänen wie z.B. einer amphipatischen a-Helix bestehen. Die im äußeren Schirmanteil vorhandene Ladung der Oleosine und die dadurch entstehende Ab­stoßung zweier Oleosome ist hauptverantwortlich für die Stabilität von Soja­milch, aber auch der Grund dafür, dass Samen teilweise noch nach Jahrhunderten ihre Keim­fähigkeit nicht verlieren.

Damit wird auch verständlich, warum Sojamilch, Tofu oder Sojasahne extrem gute Emulgatoren sind. Sojamilch beinhaltet mit die stärksten Emulgatoren überhaupt: Phospholipide, Oleosine – also Proteine, die sehr stark zur Stabilität beitragen – und Ölkörperchen, die alle auf verschiedenen Längenskalen ihren Beitrag leisten.

Damit ist die Oberfläche der Oleosome auf natürliche Weise „funktionalisiert“, denn je nach pH-Wert der Umgebung ist die Oberfläche mit unterschiedlichem Vorzeichen geladen (Abb.2).

Unterhalb des isoelektrischen Punktes ist die Nettoladung der Oberfläche positiv, oberhalb negativ. Daher sind Oleosome gerade im sauren und damit im kulinarisch relevanten ­Bereich von pH-Werten um 4 leicht positiv geladen. Sie bilden stabile Emulsionen und können auch entsprechend verkapselt werden, z.B. mit negativ geladenen Hydrokolloiden.

Extraktion

Oleosome werden in mehreren Schritten mittels Zentrifugation aus roher gefilterter Sojamilch isoliert. Dabei wird die Aufrahmung der Oleosome beschleunigt, diese wird dabei von den restlichen Bestandteilen der Sojamilch getrennt. Insbesondere der pH-Wert der rohen Sojamilch und der des in den Waschschritten benutzten Mediums hat einen großen Einfluss auf den Erfolg der Abtrennung der Speicherproteine. Bei einem stark basischen pH-Wert von 11 wird eine Trennung der Oleosome von den Speicherproteinen Glycinin und ß-Conglycinin und anderen Allergenen wie der Thiolprotease „Gly m Bd 30K“ erreicht [4].

Blick ins Oleosom: Neutronenstreuung

Obwohl verschiedene Modelle und Simulationen zur Konformation der Oleosine innerhalb der Oleosome existieren, ist deren Faltung auf molekularer Ebene nicht endgültig geklärt. Auch ist es schwierig, kleine Änderungen in der Konformation der Proteine (wie man sie beispielsweise zu Beginn einer thermischen Denaturierung erwartet) durch makroskopische Messungen an intakten Oleosomen nachzuweisen. Eine vielversprechende Methode, um hier genauere Einblicke zu erlangen, ist die Neutronenstreuung. Neutronen wechselwirken mit den Kernen der Atome und besitzen die Besonderheit, an Iso­topen des gleichen Elements unterschiedlich stark gestreut zu werden. Dies ist insbesondere der Fall für Wasserstoff (H) und Deuterium (D). Dadurch eröffnet sich die Möglichkeit, bestimmte Teilstrukturen einer Probe auszublenden oder hervorzuheben, indem deren Streulängendichten durch Austausch von Wasserstoff mit Deuterium variiert werden. So bietet sich im Fall der Oleosome die Möglichkeit, sie statt in Wasser in ­Mischungen verschiedener H2O/D2O-Verhältnisse zu dispergieren, damit das normalerweise dominierende Signal des Öls zu unterdrücken und das schwache, aber besonders interessante Signal der Proteinhülle hervorzuheben. Dies ist in Abbildung 3 gezeigt, wo die Streusignale von Sojaoleosomen mit denen einer ebenfalls sojaöl- und lecithinbasierten, aber proteinfreien ­Modellemulsion (Intralipid) jeweils sowohl in reinem H2O (0% D2O) und in 12%igem D₂O dargestellt sind.

Es ist ersichtlich, dass sich die Signale der beiden Proben für reines Wasser kaum unterscheiden, für die 12%ige D₂O-Mischung aber deutlich verschieden sind. Dies liegt daran, dass 12%iges D2O aus Sicht der Neutronen kaum von Sojaöl zu unterscheiden ist und das resultierende Signal daher von der Proteinhülle dominiert wird. In Wasser dominiert dagegen das Signal des Öls. Indem man die Streukurven mit den für bestimmte Strukturen und H₂O/D₂O-Verhältnisse berechneten vergleicht, lässt sich eine Aussage über die Struktur der Probe treffen. Im hier gezeigten Beispiel erkennt man gut, dass sich für reines Wasser zwar sowohl Oleo­some als auch Intralipid annähernd mit einem einfachen Kugelmodell beschreiben lassen, dies im Fall der 12%igen D₂O-Mischung aber nur noch für das proteinfreie Intralipid der Fall ist. Um das von den Oleosomen verursachte Signal zu beschreiben, ist es nötig, das kompliziertere Modell einer Kugel mit einer Schale zu verwenden. Durch Anpassung des Modells an die Streukurve können dann Parameter wie Größe der Oleosome und Schalendicke bestimmt werden. Hier ergeben sich ein Durchmesser von 290?nm und eine Schalendicke von 7nm, was mit der oben genannten Modellvorstellung zum Aufbau des Oleosomes verträglich ist.

Verhalten an Grenzflächen

Das grundsätzliche Verhalten der Oleosome an Grenzflächen ist in Abbildung 4 dargestellt. ­Erreicht ein Oleosom die Luft-Wasser-Grenz­fläche, verändern die Oleosine an der Ober­fläche ihre Konformation, sobald sie mit Luft (die als hydrophob angesehen werden kann) in Kontakt kommen. Das Ölkörperchen verliert ­dadurch seine Stabilität, reißt auf und seine Kom­ponenten formieren sich zu neuen Strukturen. Hierbei ordnen sich die grenzflächenaktiven Phospholipide wie gezeigt an der Ober­fläche an, das Öl sammelt sich ebenfalls an der Ober­fläche. Nicht abschließend geklärt ist das Verhalten der Oleosine, die aufgrund ihres amphiphilen Charakters ebenfalls die Möglichkeit haben, sich entlang der Grenzfläche anzuordnen, aber auch wie gezeigt mizellenartige Aggre­gate bilden können, bei denen die hydro­phoben Teil­sequenzen von den hydrophilen eingeschlossen werden und die somit wasserlöslich sein könnten. Zur Klärung bedarf es weiterer Untersuchungen (Lichtstreuung, Spektro­skopie, …).

Damit sind Oleosome auch im Kosmetik­be­reich relevant. In verdickten wässrigen Lösungen werden sie durch langsame Verdunstung des Lösungsmittels platzen und somit ihren Ölkern langsam freigeben.

Oleosome und innovative Lebensmittel

Die funktionalisierten Oberflächen der Nano- und Mikropartikel lassen sich nützen, um die Ölkörperchen zu strukturierten Aggregaten zu verbinden oder sie zu festen und halbfesten ­Bestandteilen für neuartige Lebensmittel zu verarbeiten.

Erste Versuche zeigen bereits einen Teil der Möglichkeiten auf. Zum einen überwiegen im basischen Bereich bzw. in der Nähe des isoelektrischen Punkts negativ geladene Aminosäuren in den hydrophilen Bereichen der Oleosine, die durch Ca²⁺-Ionen verknüpft werden können und damit bereits zu einer leichten Stabilitätserhöhung führen (siehe Abb.5). Zum anderen lassen sich die hydrophilen Teile der Proteine an den Oberflächen mit dem Enzym Transglutmaninase permanent vernetzen. Da Transglutaminase zur Entfaltung ihrer maximalen Aktivität Calcium benötigt, entsteht eine maximale Verfestigung der Emulsion aber erst im Zusammenspiel der beiden Stoffe.

Mithilfe von Oleosomen können somit proteinhaltige Lebensmittel mit einem über ihren Fettanteil steuerbaren Energieinhalt entwickelt werden. Diese sind auch für die Geriatrie zur Vorbeugung und Therapie bei Mangelernährung interessant, insbesondere deshalb, weil die Textur (und damit die Schluckbarkeit bei gleichzeitig vorliegender Dysphagie) definiert verändert werden können [5]. Wird noch in Rechnung gestellt, dass Oberflächen und Ölkern mit bioaktiven Stoffen unterschiedlicher Löslichkeit (wasser- und fettlösliche Vitamine, Phenole usw.) beladen werden können, haben Oleo­some gute Chancen, zu natürlichen biofunktionalen Carrierpartikeln zu werden.

Literatur
[1] Bresinsky, A., Körner, C., Kadereit, J. W., Neuhaus, G., Sonnewald, U. (2008) Strasburger, Lehrbuch der Botanik, 36th ed. Spektrum Akademischer Verlag
[2] Huang, A. H. C. (1992) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43 (1), 177–200
[3] Maurer, S. et al. (2013) J. Phys. Chem. B 117 (44), 13872–13883
[4] Waschatko, G. et al. (2012) J. Phys. Chem. B 116, 10832–10841
[5] Vilgis, T. A., Lendner, I., Caviezel, R. (2014) Ernährung bei Pflegebedürftigkeit und Demenz Lebensfreude durch Genuss, Springer

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