Struktur und Funktion von Tc-Toxinen

Bakterielle Giftspritzen

von Prof. Dr. Stefan Raunser, Dr. Christos Gatsogiannis, Dominic Meusch

Das insektenpathogene Bakterium Photorhabdus luminescens enthält eine Vielzahl an toxischen Proteinen, unter anderem Tc-Toxine, mit denen es Wirtszellen innerhalb kürzester Zeit töten kann. Tc-Toxine formen einen speziellen Proteinkomplex, der ein „Killerenzym“ in einem Kokon aufbewahrt und erst nach Kontakt mit dem Wirt über einen neuartigen, spritzenähnlichen Mechanismus in die Zelle injiziert. Dort entfaltet das Killerenzym seine giftige Wirkung und führt zur Aggregation des Zytoskeletts und letztendlich zum Zelltod. ­Dieser Mechanismus ist von grundlegender Bedeutung für das ­allgemeine Verständnis des Transports von Wirkstoffen durch Membranen und könnte sogar für gezielte medizinische ­An­wendungen infrage kommen.

Eine ungewöhnliche Bakterien-Fadenwurm-Symbiose

Das Bakterium Photorhabdus luminescens lebt mit millimeter­großen Fadenwürmern in einer ungewöhnlichen Symbiose, die für ­beide Organismen überlebensnotwendig ist [1]. Die Fadenwürmer befallen Insektenlarven und setzen in deren Inneren die Bakterien frei. Die Bakterien stellen umgehend eine Vielzahl an toxischen Proteinen her, mit denen sie die Insekten in kürzester Zeit töten. Der tote Insekten­kadaver dient den Bakterien als Nahrungsquelle und die Fadenwürmer ernähren sich von den vollgefressenen Bakterien, bevor sie neue Insekten befallen. Diese spezielle Symbiose zwischen Bakterien und Fadenwürmern wird heutzutage erfolgreich als biologisches Schädlingsbekämpfungsmittel gegen spezielle Insekten verwendet.

Tc-Toxine arbeiten als Nanospritzen

Unsere Arbeitsgruppe konzentriert sich auf die erst vor Kurzem identifizierten Tc-Toxine aus Photorhabdus luminescens. Tc-Toxine sind aus einer A- (TcA) , B- (TcB) und C-Komponente (TcC) aufgebaut und werden daher auch ABC-Toxine genannt. Hierbei bilden die Proteine TcB und TcC einen Subkomplex, der stabil an TcA bindet [2]. Der gesamte Tc-Toxinkomplex wird benötigt, um die eigentliche toxische Komponente (hier TcC) in die Wirtszelle zu befördern. Diese Komponente modifiziert Aktin­moleküle, was im weiteren Verlauf zu deren unkontrollierten Polymerisation führt, das Zyto­skelett der Wirtszelle zusammenbrechen lässt und einen schnellen Zelltod herbeiführt. Wie diese toxische Komponente in die Wirtszelle gelangt, um diese zu töten, war bislang noch ungeklärt. Um herauszufinden, wie der Mechanismus der Übertragung der toxischen Komponente genau funktioniert, ermittelten wir zunächst die Struktur eines Tc-Toxins mithilfe der dreidimensionalen Kryo-Elektronenmikroskopie. Bei dieser Methode werden große Proteinkomplexe mithilfe von flüssigem Ethan bei -196C innerhalb von Millisekunden in amorphem Eis eingefroren. Anschließend werden Projektionsbilder der eingefrorenen Komplexe an einem Elektronenmikroskop aufgenommen. Durch Übereinanderlagerung vieler Projektionsbilder in unterschiedlichen Ansichten wird eine dreidimensionale Struktur der Moleküle zurückgerechnet. Mit modernen Elektronenmikro­skopen können mit dieser Methode Auflösungen im atomaren Bereich erzielt werden. Unsere kryo-elektronenmikroskopische Struktur von TcA hatte eine Auflösung von 6,3Å. Bei dieser Auflösung kann man Protein-Sekundärstrukturen wie z.B. Helices identifizieren. Hierbei zeigte sich, dass TcA einen birnenförmigen Komplex aus fünf TcA-Einzelmolekülen bildet, d.h. ein Homopentamer. Des Weiteren kann man bei dieser Auflösung erkennen, dass der Komplex aus einem zentralen Kanal und einer äußeren Hülle besteht (Abb.1). Wir fanden ­heraus, dass sich die äußere Hülle in einem ­extrem basischen oder extrem sauren Milieu öffnet und dass der zentrale Kanal wie eine Injektionsnadel in eine Lipiddoppelschicht inseriert [3]. Hierbei geht das Öffnen der äußeren Hülle mit einer starken Konformationsänderung in der Hülle einher. Die Konformation des zentralen Kanals bleibt weitestgehend unverändert.

Die Nanospritze im Detail

Um eine Struktur des Komplexes bis ins atomare Detail zu erhalten, züchteten wir mikrometergroße Proteinkristalle (Abb.2) und analysierten diese mittels Röntgenkristallografie. Bei dieser Technik werden die dreidimen­sionalen Proteinkristalle bei Temperaturen von -196C mit Röntgenstrahlung beschossen. Die Röntgenstrahlen werden an den Atomen der Tc-Toxine im Proteinkristall abgelenkt und durch ein Streumuster auf einem Detektor in zwei ­Dimensionen sichtbar gemacht. Durch Drehung des Proteinkristalls um jeweils 0,25 bis 1 Grad wird eine dritte Dimension erzielt. Dadurch kann man zwar die Intensitäten der gebeugten Strahlung messen, um aber die dreidimensionale Struktur der Tc-Toxine daraus ermitteln zu können, benötigt man auch die Phaseninfor­mation der Strahlung, die leider beim Diffrak­tionsexperiment verloren geht. Dieses so genannte Phasenproblem haben wir mithilfe unserer kryo-elektronenmikroskopischen Struktur gelöst und deren Phasen für die Strukturauflösung von TcA bis zu einer Auflösung von 3,9Å benutzt. Bei dieser Auflösung sieht man nicht nur Helices und ß-Faltblätter, sondern man kann auch große Seitenketten identifizieren. In ähnlicher Weise haben wir auch die Struktur von TcB-TcC bei einer Auflösung von 2,5Å berechnet. Genauer gesagt wurden in monatelanger Arbeit circa 25000 Aminosäuren für TcA und circa 2000 Aminosäuren für TcB-TcC am Computer in die Elektronendichten gebaut, um die Struktur beider Proteinkomplexe zu erhalten. Die Struktur von TcA enthält eine ungewöhnlich gestreckte Region, die den zentralen Kanal mit der äußeren Hülle des Toxins verbindet [4]. Bei extrem basischem oder saurem ­pH-Wert öffnet sich die äußere Hülle und die gestreckte Region vollzieht eine Konformationsänderung, d.h., sie faltet sich in eine energetisch günstigere Konformation und zieht dabei den zentralen Kanal hinter sich her. Hierbei durchdringt dieser die Lipiddoppelschicht der Wirtszelle, damit die toxische Komponente in das Innere der Wirtszelle übertragen werden kann (Abb.3) [4]. Dieser Prozess ist vergleichbar mit einer Spritze, deren Injektion durch einen Feder­mechanismus betrieben wird. Damit die toxische Komponente in die Wirtszelle übertragen werden kann, muss TcA in der Nähe der Zellmembran stabilisiert werden, z.B. durch Bindung an einen Rezeptor. Hierfür konnten wir auf der äußeren Hülle von TcA insgesamt 20 potenzielle rezeptorbindende Domänen identifizieren, die eine Rolle bei der Fixierung von TcA an der Wirtszellmembran spielen könnten. Des Weiteren könnten diese rezeptorbindenden Domänen eine wichtige Funktion in der Spezifität von verschiedenen A-Komponenten bei der Bindung an bestimmte Zelltypen widerspiegeln.

Abb.3 pH-abhängige Konformationsänderung in TcA. Bei extrem sauren und basischen pH-Werten öffnet sich die äußere Hülle (blau) der Nanospritze, die gespannte Feder (lila) faltet sich in eine energetisch günstigere Konformation und zieht dabei den zentralen Kanal (cyanblau) hinter sich her, der im letzten Schritt durch die Wirtszellmembran schießt (grün).

Abb.4 Struktur der BC-Komponente. TcB (gold) und TcC (lila) bilden einen dimeren Komplex, der ­einen hohlen Kokon aufbaut. Die Struktur wurde ­mittels Röntgenkristallografie bei einer Auflösung von 2,35 Å ermittelt.

Das Killerenzym wird von einem Kokon geschützt

TcB und TcC bilden zusammen einen heterodimeren Komplex, der eine hohle, kokon­förmige Struktur ausbildet (Abb.4). Im Inneren des Komplexes befindet sich die toxische Komponente, die sich aus dem C-terminalen Ende von TcC aufbaut. Sie wird autoproteolytisch durch eine interne Aspartatprotease von TcC abgespalten und liegt anschließend in einer wahrscheinlich ungefalteten Form im Kokon vor. Die toxische Komponente ist daher nicht nur vor ihrer Umgebung durch den Kokon geschützt, sondern der Kokon sorgt auch dafür, dass das Killerenzym nicht vor seiner Injektion in die Wirtszelle freigesetzt werden kann. Der Kokon, bestehend aus TcB und TcC, bindet an die Nanospritze des TcA-Komplexes. Hierbei öffnet sich der Kokon und das Killerenzym wird in den Kanal der Nanospritze übertragen. Die Nanospritze wiederum bindet mit ihren rezeptorbindenden Domänen an Rezeptoren der Wirtszellmembran und wird dort stabilisiert. Durch eine extreme Änderung des pH-Wertes schießt der innere Kanal der Nanospritze wie zuvor beschrieben durch die Wirtszellmembran und überträgt das Killerenzym in das Innere der Wirtszelle. Dieses faltet sich dort in seine natürliche Konformation und führt innerhalb kürzester Zeit zum Tod der Wirtszelle (Abb.5).

Ausblick

Tc-Toxine kommen nicht nur in insektenpathogenen Bakterien vor, sondern auch in humanpathogenen Bakterien wie z.B. Salmonellen oder ­Yersinia pestis, dem Erreger der Lungen- und Beulenpest. Aus medi­zinischer Sicht ist es wichtig, den Infektionsmechanismus dieser Tc-Toxine zu untersuchen, um daraus Information für die Entwicklung von spe­zifischen Antibiotika zu erlangen. Auf der Ebene der Wirtszellspezifität könnte eine genaue Analyse der rezeptorbindenden Domänen die spezifischen Rezeptoren auf den jeweiligen Zellen identifizieren. Zusätzlich könnte diese Analyse ein erster Ansatzpunkt sein, um in Zukunft Tc-Toxine zu generieren, die spezifisch an Rezeptoren bestimmter Zellen binden. Durch Übertragung eines Killer­enzyms bzw. Reparaturproteins könnten die Zellen gezielt und effektiv getötet bzw. geheilt werden. Zusammengefasst könnten Tc-Toxine in Zukunft als „Cargotrans­porter“ in der Medizin eingesetzt werden, um spezielle Wirkstoffe in die Zielzelle zu transportieren. Unsere strukturbiologischen Analysen eines Tc-Toxinkomplexes geben erste Einblicke in das breite Spektrum der ­Anwendung sowohl für die Medizin als auch die Nanowissenschaften. 

Literatur
[1] Joyce, S. A. et al. (2006) Curr. Opin. Microbiol. 9, 127–132
[2] Lang, A.E. et al. (2010) Science 327,1139–1142
[3] Gatsogiannis, C. et al. (2013) Nature 495, 520–523
[4] Meusch, D. et al. (2014) Nature, 508, 61-65