Eine neue, leistungsfähige Methode zur Trennung und Fraktionierung von Nanopartikeln, Proteinen und Biopolymeren

AF4 plus HF5 gleich Separation hoch zwei

von Dr. Christoph Johann, Dr. Thomas Jocks

Die Fluss-Feldflussfraktionierung (F4) ist eine Familie von universellen Trennmethoden für Moleküle und Partikel, bei der man sich einen hydrodynamischen Querfluss senkrecht zur Hauptströmungsrichtung für die Separation zunutze macht. Bekannt und bereits verbreitet ist die asymmetrische Fluss-Feldflussfraktionierung (AF4), bei der ein flacher, länglicher Kanal eingesetzt wird und die im Vergleich zur symmetrischen Fluss-FFF (SF4) verbesserte Trennleistungen und Probenkapazitäten zeigt. In diesem Beitrag wird die Hohlfaser-Fluss-FFF (HF5) vorgestellt, die nun erstmalig kommerziell praxistauglich verfügbar ist (Wyatt Technology Europe).

Die Hohlfaser-Fluss-FFF (HF5)

Der Kanal der HF5 besteht aus einer semipermeablen Membranfaser mit porösen Wänden. Wird ein Flüssigkeitsstrom, also beispielsweise ein wässriger Puffer mit gelösten oder in Suspension befindlichen Bestandteilen, durch die Faser hindurch gepumpt, so kann ein Teil der Strömung durch die Wände austreten und bildet eine Querströmung (CrossFlow) im Verhältnis zur Hauptströmung, die entlang der Faser in Richtung Kanalauslass gerichtet ist. Durch Einwirkung des Querstromes, der sich mit dem parabolischen Flussprofil der Längsströmung überlagert, erfolgt eine Trennung der Probenbestandteile. Diese Trennung beruht auf den unterschiedlichen Diffusionskoeffizienten der zu separierenden Komponenten und damit auf dem hydrodynamischen Radius bzw. der Molekülmasse (Abb. 1).
Der Einsatzbereich der HF5 ist ähnlich breit gefächert wie bei anderen Feldfluss-Fraktionierungstechniken. Der dynamische Massen- bzw. Größenbereich ist wesentlich größer als bei jeder Säulenchromatografie und reicht ungefähr von 1 nm bis 50 ?m. Dabei lassen sich sowohl ge löste Moleküle als auch Partikel im gleichen Trennungsgang untersuchen. Dieser Umstand kommt z.B. dann zum Tragen, wenn „freies“ Reagenz unterschieden werden soll von dem Anteil, der an Partikel gebunden hat. Das ist eine Aufgabe, die sich vor allem bei der Entwicklung von „Colloidal DrugCarrier“ Systemen stellt [1]. Ein besonderer Vorzug dieser Trennmethode ist auch, dass sie – anders als die SEC-Säulenchromatografie (Size Exclusion Chroma tography) – ohne stationäre Phase arbeitet. Daher werden Wechselwirkungen wie zum Beispiel Adsorption von Analyten oder Matrixkomponenten und auch Verstopfungen vermieden.
Ein besonderer Vorteil ist die geringe Probenverdünnung und damit hohe Nachweisempfindlichkeit, die aus dem Kanalvolumen von weniger als 100 ?L und den niedrigen Detektorflussraten resultiert. Daher bietet es sich an, die HF5 als Trennverfahren für die anschließende Analyse mittels Massenspektrometrie einzusetzen. Bereits vorliegende Ergebnisse belegen, dass die HF5 das Potenzial hat, zu einem wichtigen Werkzeug in der ProteomicsForschung zu werden [25]. Überdies stellt auch die Umweltanalytik ein Anwendungsgebiet dar, etwa dann, wenn es um den Nachweis von möglicherweise schädlichen Nanomaterialien in Luft und Boden, in Lebensmitteln und anderen Produkten geht.

Das Herzstück der Trennung: der HF5-Kanal

Das Polymer, aus dem die Hohlfasern hergestellt werden, ist relativ preiswert, sodass kostengünstige HF5Kartuschen als Einmalartikel verfügbar sind. Dies eliminiert auf elegante Weise sämtliche Probleme, die sich in der Vergangenheit bei manchen Anwendungen stellten, etwa bei sterilen Arbeiten oder falls eine Probenverschleppung zwischen den Versuchsreihen unter allen Umständen ausgeschlossen werden soll. Der in Abb. 2 gezeigte HF5Kanal stellt eine zum Patent angemeldete Neukonstruktion dar. Das Gehäuse ist 17 cm lang und besitzt neben einer Reihe von Dichtungselementen zwei Endfittings für den Anschluss an die Flusssteuerung durch das Eclipse DUALTEC – Instrument (Wyatt Tech nology Europe). Die Besonderheit dieses Gerätes besteht darin, dass es sämtliche Flüsse und Drücke, die für die Fraktionierung erforderlich sind, aus dem Fluss bzw. Druck erzeugt, der von einer einzigen Pumpe bereitgestellt wird – im Gegensatz zu anderen Systemen, die bis zu drei unterschiedliche Pumpen benötigen. Allein dies verdeutlicht, dass das Arbeiten mit der Eclipse vergleichsweise einfach ist. Auch der Aufwand für Installation, Steuerung und Wartung ist wesentlich niedriger, was sich demzufolge auch kostenseitig positiv bemerkbar macht. Die Kartusche ist für einen Maximaldruck von 30 bar ausgelegt. Das verwendete Hohlfaserelement besteht aus Polyethersulfon, hat einen Innendurchmesser von 0,8 mm und ist in 10 und 30 kDa-Ausschlussgrenzen erhältlich. Abbildung 3 zeigt die Rasterelektronenmikroskopaufnahme (REM) einer solchen Hohlfaser. Die Kartusche besitzt – zusätzlich zum Crossflow Auslass – jeweils pumpenseitig eine Einlass- und detektorseitig eine Auslassöffnung wie eine Chromatografiesäule. Während in der AF4 der Kanal geöffnet werden muss, um die Flachmembran zu wechseln, kann in der HF5 der gesamte Kanal bzw. die Trennkartusche wie ein Einmalartikel sofort ausgewechselt werden, wodurch sich die Produktivität deutlich erhöht.
Im normalen Betrieb sollte der Wechsel etwa alle 50 Läufe oder nach zwei Wochen durchgeführt werden. Der Anwender kann aber auch selbst erkennen, wann dies nötig ist, zum Beispiel, sobald die normalerweise symmetrischen Peaks (etwa beim Kontrollansatz mit BSA) ein deutliches „Tailing“ zeigen oder wenn die Wiederfindung der Probe deutlich absinkt. Auch ein Druckanstieg im System deutet auf diesen Zeitpunkt hin. Die HF5 ist diejenige Methode in der Fluss-FFF-Familie, die eine hohe Trennleistung mit geringer Probenverdünnung und damit hoher Nachweisempfindlichkeit der Detektion verbindet. Aus diesen Stärken ergeben sich naturgemäß auf der anderen Seite die Limitationen der HF5. Der kleine Kanal wird bei zu hoher Probenbeladung Überladungseffekte zeigen. Es ist deshalb wünschenswert, die HF5 als zusätzliche Methode zur Verfügung zu haben, ohne auf die Flachkanal Fluss-FFF (AF4) verzichten zu müssen. Daher war die Entwicklung eines Systems für die Feldflussfraktionierung notwendig, das sowohl mit AF4- als auch mit HF5-Trennkanälen betrieben werden kann. Es erlaubt, von nur einem Instrument gesteuert, den flexiblen Wechsel zwischen den beiden Trennmodi. Damit ist die Feldflussfraktionierung nicht aufwändiger als eine HPLC-Trennung – im Gegenteil. So beträgt beispielsweise die Zeit, die man zum Umspülen zwischen verschiedenen Trennläufen benötigt, in der Regel nur 10 bis 15 Minuten. Auch in Bezug auf Reproduzierbarkeit und Wiederfindung ist die HF5 als sehr robuste Methode zu bezeichnen (siehe hierzu auch Tabellen 1 und 2).

Der neue AF4-Kanal

Um das Umschalten zwischen beiden Trennmodi zu vereinfachen, wurde ein völlig neuer AF4-Kanal entwickelt. Dieser besitzt wie die HF5-Kartusche nur zwei Anschlussöffnungen. Die Injektion der Probe erfolgt mit der mobilen Phase über den Einlass. Die Abdichtung des Kanals – früher ein neuralgischer Punkt in solchen Systemen – wird im neuen Kanal mithilfe einer speziell konstruierten Dichtfläche erreicht (zum Patent angemeldet), die gegenüber herkömmlichen Konstruktionen keine Spacerfolien und weniger Anpressdruck benötigt. Diese Technik ermöglicht auch die Konstruktion großer Kanäle, die beispielsweise für semi-präparative Trennungen geeignet sind.

Ergebnisse und Diskussion

Reproduzierbarkeit der Trennung

Um die Qualität der Separation und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse beim Einsatz des neuen Hohlfaserkanals zu überprüfen, wurden 50 Trennläufe mit Rinderserumalbumin (BSA) nacheinander auf derselben HF5-Kartusche durchgeführt. In der Tabelle 1 ist die Statistik der wichtigsten Kenndaten dieser Ansätze zusammengefasst. Die Daten machen deutlich, dass die Reproduzierbarkeit zwischen den Läufen sehr gut ist. Die Kartusche ermöglicht für mindestens 50 Läufe praktisch deckungsgleiche Fraktogramme mit Basislinientrennung. Die Wiederfindungsrate liegt stabil bei 80 %. Die Methode erweist sich damit als äußerst robust im Vergleich zur HPLC. In weiteren Versuchen konnte die hohe Reproduzierbarkeit selbst noch nach 100 Trennungen nachgewiesen werden (Daten hier nicht gezeigt). Auch zwischen verschiedenen Kartuschen sind die Messungen sehr stabil und liegen im selben Bereich. Tabelle 2 zeigt 3 Trennläufe nach Kartuschentausch: Die Parameter besitzen ähnliche Werte mit niedrigen statistischen Differenzen. Dies lässt auf eine hohe Reproduzierbarkeit von Modul zu Modul schließen.

Höhere Nachweisempfindlichkeit

Eine weitere wichtige Eigenschaft der Hohlfasertechnik ist die geringere Probenverdünnung – verglichen mit der AF4. Dadurch wird eine höhere Nachweisempfindlichkeit ermöglicht (Abb. 4). Gezeigt ist die Höhe des UV-Signals als Funktion der Aufgabemenge des Enzymproteins Carboanhydrase (CAH) im Vergleich zwischen HF5 und zwei verschiedenen AF4 Kanälen, (SC – short channel und LC – long channel). Die Kanalhöhe ist vergleichbar (HF5 Radius 400 ?m, Kanalhöhe der AF4 Kanäle 350 ?m). Aufgrund des geringen Kanalvolumens von 100 ?L sind die Peaks nach der HF5 Trennung um den Faktor 4 bzw. 6 höher. Abbildung 5 zeigt das Fraktogramm aus der Trennung eines Proteingemischs. Die enthaltenen Komponenten – sowohl Monomere als auch Oligomere – sind problemlos nachweisbar. Es wird nahezu Basislinientrennung erreicht.

Berechnung der Fraktogramme

Die theoretischen Grundlagen der FFF-Trennung sind sehr detailliert beschrieben. Daher lässt sich das Trennergebnis – das Fraktogramm – vorhersagen, wenn die Größe der Probenbestanteile vorgegeben ist. Umgekehrt kann man aus der experimentellen Retentionszeit die Größe der jeweiligen Fraktion berechnen. Dieser Zusammenhang kann zur Methodenentwicklung genutzt werden. Dazu hat Wyatt unter der Bezeichnung „ISIS“ eine Software entwickelt, die es auch einem unerfahrenen Anwender leicht macht, für den jeweiligen Fall die optimale Trennmethode zu erarbeiten.

Schlussfolgerungen

Die Resultate aus dieser Studie machen deutlich, dass die HF5 mit dem hier vorgestellten System eine ebenso gute Trennung zeigt wie die bereits bewährten AF4-Kanäle. Der „DUALTEC“-Ansatz bietet dem Nutzer ein Höchstmaß an Sensitivität, Flexibilität und Produktivität. Nicht nur ist der Arbeitsbereich wesentlich größer als bei der SEC/GPC. Auch sorgen das Fehlen jeglicher Wechselwirkung mit dem Säulenmaterial sowie die Vermeidung von Scherkräften selbst bei empfindlichem Probenmaterial für eine saubere, robuste und schonende Auftrennung. Dies dürfte vor allem den Anwendern Vorteile bringen, die mit ihren komplexen Proteinmolekülen und großen Partikeln in der Vergangenheit mit der Säulenchromatografie schnell an die Grenzen des Machbaren stießen. Speziell die einfache Handhabung der Hohlfaser bei außergewöhnlich guten Trennergebnissen auch mit „Problemkandidaten“ kann sich hier durchaus als überlegener Ansatz erweisen. So gesehen wäre es erstaunlich, wenn die „Eclipse DUALTEC“ HF5/AF4-Technologie in nächster Zeit nicht eine stattliche Anzahl neuer Nutzer aus den verschiedensten Anwendungsgebieten gewinnen könnte.

Um die Tabellen zu sehen, laden Sie sich bitte das vollständige PDF (oben rechts) herunter

Literatur beim Verfasser

[1] Zattoni A, Rambaldi D, Reschiglian P, Melucci M, Krol S, Coto Garcia AM, Sanz-Medel A, Roessner D, Johann C., J Chromatogr A 1216:9106-9112 (2009).
[2] P. Reschiglian, A. Zattoni, L. Cinque, B. Roda, D. Melucci, F. Dal Piaz, A. Roda, M.H. Moon, B.R. Min. Anal. Chem. 76, 2103-2111(2004).
[3] P. Reschiglian, A. Zattoni, B. Roda, L. Cinque, D. Parisi, A. Roda, M. H. Moon, B. R. Min, F. Dal Piaz, Anal. Chem. 77, 47-56 (2005).
[4] A. Roda, D. Parisi, M. Guardigli, A. Zattoni, P. Reschiglian, Anal. Chem. 78, 1085-1092 (2006).
[5] A. Zattoni, D.C. Rambaldi, B. Roda, D. Parisi, A. Roda, M.H. Moon, P. Reschiglian, J. Chromatogr. A 1183, 135- 142 (2008).
[6] S. K. Ratanathanawongs Williams, D. Lee, J. Sep. Sci. 29, 1720 – 1732 (2006) .

Foto: © Dr. Thomas Jocks