Fischallergie Test - Fischallergennachweis in Lebensmitteln mit impedimetrischen Biosensoren

Versteckte Fischproteine

von Dr. Bettina Albrecht, Dipl.-Ing. (FH) Stefan Hartwich, Dr. Zhenzhen Wen, Prof. Dr. Christine Wittmann

Dr. Bettina Albrecht, Dipl.-Ing. (FH) Stefan Hartwich, Dr. Zhenzhen Wen, Prof. Dr. Christine Wittmann, Fachbereich Agrarwirtschaft und Lebensmittelwissenschaften, Hochschule Neubrandenburg

Fisch gilt nicht nur als eine sehr wertvolle Proteinquelle, sondern ist auch durch seinen hohen Gehalt an ungesättigten essenziellen Fettsäuren und fettlöslichen Vitaminen in unserer Ernährung von großer Bedeutung. Fische enthalten allerdings auch Proteine der Parvalbumin-Familie, die bei einem nicht zu vernachlässigenden Anteil unserer Bevölkerung IgE-vermittelte klinische Symptome wie Hautausschlag, Anschwellen der Schleimhäute, Durchfall, Blutdruckabfall, Atemnot bis hin zum anaphylaktischen Schock und Tod führen können. Fischallergiker werden deshalb nach Möglichkeit Fisch von ihrem Speiseplan streichen. Doch wie sollen sie sich schützen, wenn Fischprotein in komplexen Lebensmitteln wie zum Beispiel Frühlingsrollen oder Steaksaucen versteckt enthalten ist?

Kennzeichnungspflicht für Allergene

Seit dem 25. November 2005 ist europaweit eine Allergenkennzeichnung in Kraft getreten, der zufolge auch in Deutschland gemäß Lebensmittelkennzeichnungsverordnung (Auflistung der Allergene in Anlage 3 LMKV) Lebensmittel, die Allergene wie Nüsse oder Fisch enthalten, gekennzeichnet werden müssen. Die Einführung eines Grenzwertes von 1 mg Allergen/kg Lebensmittel wurde bislang zwar diskutiert, eine Einigung konnte aber in den entsprechenden Gremien noch nicht erzielt werden. Im Hinblick auf Transparenz und Qualitätssicherung ist sowohl für den Verbraucher als auch für die Lebensmittelindustrie die Entwicklung von Schnellmethoden zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Fischproteinen wünschenswert.

Parvalbumin im weißen Muskelfleisch

Parvalbumine sind kleine, hitzestabile Ca2+ -bindende Proteine mit drei EF-Hand- Motiven. Sie weisen eine hohe Homologie zu Calmodulin auf und sind sowohl in höheren als auch niederen Organismen zu finden. Parvalbumin wird in höheren Wirbeltieren in Schaltneuronen im Zentralnervensystem und Hippocampus exprimiert und spielt dort eine Rolle in der Aussendung von Gammawellen, die mittels Elektroenzephalo grafie gemessen werden können. In niederen Wirbeltieren wie zum Beispiel Fischen findet man große Mengen an Parvalbumin im schnell zuckenden weißen Muskelfleisch, wo es in den Muskelrelaxationsprozess involviert ist. Während die Homologie von murinem oder humanem Parvalbumin zu Karpfenparvalbumin nur ca. 56 % beträgt, liegt die Homologie zwischen Parvalbumin von Karpfen und Seelachs bei 76 %. Generell gilt, dass Fischallergiker oftmals nicht nur gegen eine Fischart, sondern aufgrund der hohen Sequenzhomologie der IgEBindungsepitope im Parvalbuminmolekül unter den diversen Fischspezies auch auf andere Fische allergisch reagieren. Dies ist speziell bei den Parvalbuminen von Kabeljau (Gad c1), Seelachs (The c1) und Lachs (Sal s1) der Fall. Am Rande erwähnt sei die hohe Ähnlichkeit von Fisch- und Froschparvalbuminen, verbunden mit der zu erwartenden Kreuzreaktivität von Allergikern, zu beachten in Ländern, in denen Frosch als Delikatesse verzehrt wird. Mit Ausnahme von Thunfisch, in dem Parvalbumin nur in diversen Muskelfleischbereichen enthalten ist, ist Parvalbumin in den anderen Fischspezies im gesamten weißen Muskelfleisch reichlich vorhanden.

Ein molekularer Marker

Aufgrund seiner proteolytischen Stabilität und seiner Hitzestabilität bleibt Parvalbumin auch in hitzebehandelten Produkten in seiner Struktur unverändert und eignet sich deshalb hervorragend als „molekularer Marker“ für den immunologischen Nachweis von Fisch in Lebensmitteln. Im Rahmen des vom BMBF geförderten FHprofUnd Projektes (1759X07) „Impedimetrische Biosensorplattform für die Lebensmittelanalytik-IMSENS“ werden daher im Verbund mit vier KMUs (Forschungszentrum Sensorik Greifswald e.V, DNA Diagnostik Nord, Transia und Biometec) und dem Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern (LALLF) sowohl DNA-basierte als auch immunchemisch basierte Nachweisverfahren für die Detektion von Fischallergenen in Lebensmitteln entwickelt. Das gemeinsame Projektziel des noch bis September dieses Jahres laufenden Projektes ist die Entwicklung eines impedimetrischen Biosensors, der sich gleichermaßen für den immunchemischen als auch DNA-basierten Nachweis von Fischallergenen in komplex zusammengesetzten Lebensmitteln eignet.

Einsatz im Biosensorformat

Die Grundlage der immunologischen Nachweisverfahren ist die Herstellung monoklonaler Antikörper gegen Fischparvalbumine. Dazu ist es erforderlich, die Fischparvalbumine aus dem rohen Fisch zu extrahieren und mit verschiedenen säulenchromatografischen Trennverfahren das hoch aufgereinigte Protein zu erhalten. Das isolierte und aufgereinigte Protein wird dann zur Immunisierung von Mäusen eingesetzt. Bislang wurden gemeinsam mit dem Projektpartner Biometec monoklonale Antikörper gegen eine Reihe von häufig konsumierten Fischarten entwickelt. Mithilfe dieser Antikörper konnten Sandwich-ELISAs (Enzyme-linked immunosorbent assay) zum selektiven immunologischen Nachweis von Kabeljau, Seelachs, Rotbarsch und Thunfisch etabliert werden. Die monoklonalen Fischallergen-Antikörper eignen sich auch für ihren Einsatz im Biosensorformat.

Abb. 1 Schematischer Aufbau des impedimetrischen Fischallergen-Biosensors

Beispielhaft in Abbildung 1 dargestellt, werden die Antikörpermoleküle kovalent an die mit Cystein funktionalisierte Oberfläche eines aus Gold bestehenden Interdigitalsensors gebunden und impedimetrisch die Kapazitätsänderung des Sensors nach Bindung der Fischprobe gemessen. Der so entwickelte Immunsensor (Abb. 2) wurde zur Messung verschiedener Fischproben und weiterer komplex zusammengesetzter Lebensmittel eingesetzt. Beispielhaft sollen hier die Ergebnisse einer Studie mit Parvalbumin aus Alaska Seelachs vorgestellt werden. Dabei wurde zunächst eine Probe mit aufgereinigtem Parvalbumin in einer Konzentration von 200 µg/L und als Negativkontrolle eine Probe mit einem anderen Protein (BSA: Rinderserumalbumin) in gleicher Konzentration auf den Sensor aufgebracht.

Abb. 2 Impedanzmessgerät und Lebensmittelproben

In Abbildung 3 sind die Messergebnisse dargestellt. Durch die Zugabe des gereinigten Parvalbumins auf den Sensor konnte erwartungsgemäß eine signifikante Reduktion der Kapazität von ca. 20 nF gemessen werden, während erwartungsgemäß mit dem unspezifischen Protein keine nennenswerte Veränderung feststellbar war. Auch eine DNA-basierte Messung von Fischallergenen ist neben den üblichen molekularbiologischen Verfahren wie der real-time PCR mit dem impedimetrischen Biosensor ebenfalls möglich. Gemeinsam mit den Projektpartnern werden derzeit verschiedene Sensor-Layout-Formate untersucht wie z. B. die in Abbildung 4 dargestellten Einwegsensoren auf Graphitbasis. Geplant ist ebenfalls noch eine umfassende Validierung der entwickelten Testformate angefangen vom Sandwich-ELISA über die real-time PCR bis hin zu den immunchemischen und DNA-basierten Biosensorformaten.

Abb. 3 Messergebnisse

Abb. 4 Sensor-Layout

Foto: PAUL NICKLEN