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Pflanzen im richtigen Licht

von Dr. Markus Langhans, Prof. Dr. Karin Schumacher, Prof. Dr. David G. Robinson

In allen eukaryontischen Zellen sind Sekretion und Endocytose nicht nur die Hauptverkehrsadern im zellulären Gütertransport, sondern auch wichtige Kommunikationswege zwischen Zelle und Außenwelt. Während diese Transportwege in Säuger- und Hefe-Zellen Gegenstandzahlreicher Veröffentlichungen sind, ist unser Wissen über das sog. „trafficking“ in Pflanzenzellen immer noch eher beschränkt.

Viele der aus Studien an Hefe und Säugern bekanntenmolekularen Mitspieler bei Bildung und gerichtetem Transport von Vesikeln, (wie z. B. COPI-, COPII-coats,GTPasen und SNAREs) finden sich auch in Pflanzen und haben dort ähnliche Funktionen. Jedoch weisen Pflanzenzellen eine Reihe struktureller Besonderheiten, wie mobile Dictyosomen, verschiedene Typen von Vakuolen und einen speziellen Cytokinese- Apparat auf, die auf die Existenz pflanzenspezifischer Moleküle schließen lassen. Zu erforschen, wie die Kompartimente des extrem dynamischen, pflanzlichen Endomembransystems funktionieren und miteinander kommunizieren, ermöglicht durch den Vergleich mit anderen Organismen interessante Einblick ein die Evolution der beteiligten Moleküle. Darüber hinaus bilden die zu gewinnenden Erkenntnisse aber auch wichtige Grundlagen für die Nutzung von Pflanzen als „grüne Fabriken“ in der Produktion von Pharmazeutika und Rohstoffen sowie für die Verbesserung von Ertrag und Stresstoleranz bei Nutzpflanzen.
Sollen die Wege eines Moleküls innerhalb der Zelleaufgeklärt werden, so stehen bei der Auswahl der Werkzeuge zwei Kriterien im Vordergrund: Zum einen müssen geeignete Mittel gefunden werden, um das Molekül sichtbar zu machen und so verfolgen zu können, zum anderen muss es möglich sein, die verschiedenen Stationen entlang seines Wegs eindeutig zu identifizieren. Während die Elektronenmikroskopie in Verbindung mit geeigneten Antikörpern gegen das zu untersuchende Molekül das zweite Kriterium in hervorragender Weise erfüllt, versagt sie, wenn es darum geht Moleküle in Echtzeit zu verfolgen.

Mit dem Grün Fluoreszierenden Protein (GFP) aus der Qualle Aequorea victoria hat die Natur ein Werkzeug zur Verfügung gestellt, dass es uns in Verbindung mitmoderner Molekularbiologie und der konfokalen Laser-Scanning Mikroskopie (CLSM) erlaubt, bis zu fünf verschiedene Proteine als genetische Fusion mit GFP Derivaten unterschiedlicher Fluoreszenzspektren (X-FP)simultan in einer Pflanzenzelle zu exprimieren (Abb. 1).So lässt sich durch gemeinsame transiente Expression des zu untersuchenden Proteins mit Markerproteinen für verschiedene Kompartimente seine subzelluläre Lokalisation zuverlässig und mit geringem Aufwand bestimmen. Wenn solche Experimente in Protoplasten, Pflanzenzellen deren Zellwand enzymatisch entfernt wurde, durchgeführt werden, so können durch gleichzeitige Expression biochemischer Marker für Sekretion (Α-Amylase) und vakuolären Transport (Α-Amylase fusioniert mit einer vakuolären Zielsequenz), Effekte von Überexpression und dominant-negativen Mutanten quantifiziert werden. Als Beispiel für die Aussagekraft dieser Methode wird auf Abb. 2 hingewiesen, bei der es möglich gewesen ist, eine domänspezifische Verteilung für ein im Endoplasmatischen Retikulum lokalisiertes Protein darzustellen.

Die Vorteile transienter Expressionssysteme, nahezu beliebige Kombinationsmöglichkeiten sowie geringer technischer und zeitlicher Aufwand, liegen auf der Hand. Jedoch muss berücksichtigt werden, dass die diesen Systemeninnewohnende Überexpression des interessierenden Proteins in seltenen Fällen zu Artefakten in der Lokalisation führen kann. Hier bietet sich als Alternative die Herstellung stabiler transgener Arabidopsis Linien an, die das XFP -Fusionsprotein unter seinem endogenen Promotor exprimieren und so nicht nur Einblicke in seine subzelluläre Lokalisation, sondern auch in sein Expressionsmuster gewähren (als Beispiel siehe Abb. 3).Zwar vergehen von der in Arabidopsis sehr einfachen Agrobakterien -vermittelten Transformation bis zur ersten Analyse des Materials mehrere Wochen, jedoch kann das erzeugte Material in Form homozygoter Linien beliebig propagiert werden. Mit einem solchen Ansatz konnte gezeigt werden, dass die drei Isoformen der V-ATPase, einer ubiquitären eukaryontischen Protonen-Pumpe, zwar in allen Zellen exprimiert, dort aber unterschiedlich lokalisiert sind. Darüber hinaus gelang es durch Verwendung dieser Linien nachzuweisen, dass in Pflanzen, im Gegensatz zu Säugern, das trans-Golgi Netzwerk (TGN) und das frühe Endosom identische oder zumindest überlappende Kompartimente darstellen (Abb. 4).

Durch die Verwendung induzierbarer Promotoren gelingt es darüber hinaus, Proteine von der Wiege (ER) bis zur Bahre (lytische Vakuole) zu verfolgen und so ihre Lebensdauer und andere wichtige regulatorische Parameter zu bestimmen. Kombiniert man solche Ansätze mit den vielfältigen Möglichkeiten der Arabidopsis-Genetik, so lassen sich „state of the art Ansätze“ verfolgen, dieweder in Hefe noch in Säugerzellen durchführbar sind. Last but not least hat es die „GFP-Revolution“ nicht nur ermöglicht die Fragen nach dem Wo? Wohin? Woher? von Proteinen zu beantworten, sie ermöglicht auch die In-vivo-Analyse wichtiger zellulärer Parameter wie z. B. der cytosolischen Konzentration des Botenmoleküls Calcium. Bei den im Labor von Roger Tsien, UC San Diegoentwickelten Ca2+-Sensoren („CAMeleon“) wurden die beiden fluoreszierenden Proteine CFP und YFP über eine Ca2+-bindende Proteindomäne verknüpft, die ihre Konformation in Abhängigkeit von der Ca2+-Konzentrationverändert. Durch diese intramolekulare Bewegung verändert sich der Abstand von CFP und YFP und es kommt zu einer Verschiebung im Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET), die als Verhältnis der Emission von CFP und YFP gemessen werden kann (Abb. 5).Vergleichbare Ansätze werden derzeit auch für verschiedene Metabolite und andere Signalmoleküle entwickelt, Mikroskopie und Bildanalyse entwickeln sich rasant weiter. Es kann davon ausgegangen werden, dass nicht nur der pflanzlichen Zellbiologie sondern der gesamten Pflanzenbiologie eine „leuchtende“ Zukunft bevorsteht!

Fotos: © Prof. Dr. David G. Robinson