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Vibrationsspektroskopie

Filme von proteingebundenem Wasser und lebenden Zellen

von Prof. Dr. Klaus Gerwert

Seit Jahrhunderten bemühen sich Forscher, die für unser menschliches Auge nicht mehr auflösbaren Lebensprozesse im Detail sichtbar zu machen.

Dabei haben bahnbrechende Entwicklungen von mikro(spektro)skopischen Techniken die Grenze der Auflösung immer weiter verschoben. Mit jedem Verschieben der Grenze wurden neue Welten entdeckt. Da es sich bei den biologischen Vorgängen um dynamische Prozesse handelt, möchte man aber nicht nur Schnappschüsse einzelner Zustände, sondern am besten gleich einen ganzen Film mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung aufnehmen können. Die Auflösung dieser Prozesse ist aber nicht nur von rein akademischem Interesse. Kommt es zu Störungen in den Abläufen, erkranken die Lebewesen. Daher ist es von besonderem Interesse, die Mechanismen im Detail zu verstehen. Dann kann auch die Ursache der Erkrankung elegant mit Wirkstoffen der personalisierten Medizin präzise behandelt werden, statt den Erkrankten über chirurgische Eingriffe oder Chemotherapien enorm belasten zu müssen.

Letztendlich beruhen alle Erkrankungen auf Fehlfunktionen in der Zelle, die auf Defekten der Proteininteraktion und der Proteine in den Zellen beruhen. Nur wenige Techniken sind in der Lage, sowohl lebende Zellen als auch Proteininteraktionen insbesondere an Membranen und einzelne Proteine aufzulösen (Abb. 1). Aktuelle Ansätze der Vibrationsspektroskopie, wie die zeitaufgelöste FTIR-Spektroskopie und konfokale Raman-Mikroskopie, ermöglichen aber genau diese analytische Herausforderung. Im Folgenden werden einige aktuelle Ergebnisse vorgestellt.

Infrarot- und Raman-Spektroskopie sind markerfreie Nachweismethoden

Jedes Molekül hat Schwingungen, die so charakteristisch sind wie ein Fingerabdruck. Daher kann ein Molekül ohne jede weitere Markierung anhand seiner charakteristischen Infrarot-Absorption oder seiner Raman-Emission identifiziert werden. Dazu werden Vibrationsniveaus, also die Schwingungsenergieniveaus eines Moleküls, angeregt. Deswegen spricht man in beiden Fällen von Vibrationsspektroskopie. Die Vibrationsniveaus lassen sich mit geringer Energie anregen und benötigen daher im Gegensatz zur Fluoreszenzspektroskopie keine spezifischen Fluoreszenz-Label, mit denen die zu untersuchenden Objekte, z. B. Proteine, erst markiert werden müssen. Komplementär zur Fluoreszenzspektroskopie kann die Vibrationsspektroskopie die Moleküle, und ihre biochemischen sowie strukturellen Eigenschaften direkt markerfrei nachweisen. Anders als in der Röntgenstrukturanalyse braucht z.B. ein Protein zur Strukturaufklärung nicht kristallisiert zu werden, sondern kann unter physiologischen Bedingungen beobachtet werden.

Neurodegenerative Erkrankung durch fehlgefaltete Proteinstruktur

Paradigmatisch für Proteine, die durch Fehlfaltung neurodegenerative Erkrankungen wie z.B. Alzheimer auslösen, ist das Prion-Protein. Fehlgefaltet löst es die Rinderseuche BSE oder beim Menschen die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit aus. Die Fehlfaltung des nativen, voll glykosylierten Prion-Proteins wurde von uns in nativer Membranbindung mit zeitaufgelöster FTIR-Spektroskopie analysiert [1]. Dazu wurde die Verschiebung der Amide I Bande aufgenommen. Die Lage der intensiven Amid I Bande des Proteingerüstes, die C=O-Streckschwingung, ist im Spektrum abhängig von der Sekundärstruktur des Proteins. Wir konnten zeigen, dass eine Fehlfaltung in den krankmachenden Zustand nur bei Membranbindung des Proteins erfolgt, also die Anbindung Voraussetzung für diese Fehlfaltung ist.

Zeitaufgelöste FTIR-Differenzspektroskopie an Membranproteinen

Ist ein Protein als Schlüsselbaustein eines biologischen Prozesses identifiziert, kann man den molekularen Reaktionsmechanismus mithilfe der zeitaufgelösten FTIR-Differenzspektroskopie im Detail bestimmen. Durch die Differenzbildung werden aus der Hintergrundabsorption der gesamten Probe nur die funktionell aktiven Gruppen des Proteins selektiert. Dazu muss die Proteinreaktion präzise gestartet werden. Alle Reaktionen in dem Protein werden dann simultan mit Nanosekunden-Zeitauflösung im infraroten Spektral bereich aufgenommen. Durch Vergleich mit ortsspezifischen Mutanten oder durch Isotopenmarkierung können die einzelnen IR-Banden eindeutig molekularen Gruppen des Proteins zugeordnet werden. In der Regel werden die Messungen an rekombinanten Proteinen durchgeführt.

Gebundene Wassermoleküle leiten Protonen in ein Membranprotein

Am Beispiel der lichtgetriebenen Protonenpumpe Bakteriorhodopsin wird hier die zeitaufgelöste FTIR-Differenzspektroskopie illustriert. Der Transportweg eines Protons, ausgehend von der zentralen Protonenbindestelle, der protonierten Schiff\'schen Base (PSB) über Asp85 und einem protonierten Wasserkomplex, einem so genannten Eigenkation, konnte im Detail mithilfe der zeitaufgelösten FTIR-Differenzspektroskopie nachgewiesen werden [2]. In Abbildung 2 ist der Mechanismus im Detail gezeigt. Insbesondere konnte gezeigt werden, dass die Protonenabgabegruppe sich wie eine Diode verhält, daher wurde analog der Begriff „Protonendiode“ eingeführt [3]. Dies erklärt, warum der Protonentransfer in dem Protein gerichtet ist. In freiem Wasser ist der Protonentransfer zufällig in beliebige Richtungen. Damit ein Protonengradient an der Zellmembran von dem Protein aufgebaut werden kann, hat das Protein aus dem ungerichteten Prozess in Wasser einen gerichteten Prozess in seinem Innern durch Anwendung der Gesetze der physikalischen Chemie erzeugt. Wir konnten mit unseren Beobachtungen die Ergebnisse aus der klassischen physikalischen Chemie in die heutige molekulare Biologie übertragen.

Das membrangebunden Ras-Protein

Das kleine Guanosintriphosphat (GTP) bindende Ras-Protein funktioniert als molekularer Schalter, der ein Wachstumssignal in der Zelle auslöst. In rund 30 % aller menschlichen Tumoren finden sich onkogene Mutationen mit Einfluss auf die GTPase- Aktivität des Proteins, z.B. K-Ras bei Darmtumoren. In zeitaufgelösten FTIRExperimenten kann die GTPase-Reaktion mit Hilfe von fotolabilem so genannten caged-GTP gestartet werden. Ein kurzer UV-Laserblitz spaltet die verwendete caged- Gruppe (o-Nitrophenylethyl) ab und startet somit die GTP-Hydrolysereaktion des Ras-Proteins. In der lebenden Zelle wird die Hydrolyse durch so genannte GAP-Proteine (GTPase aktivierend) katalysiert und damit geregelt. In onkogenen Mutationen kann das Ras-Protein zwar aktiviert werden, aber das Abschalten durch die Hydrolyse, insbesondere die Katalyse durch GAP, ist gestört. Damit kommt es zu unkontrollierten Wachstumssignalen, die letztendlich mit zur Krebsentstehung beitragen. In Abbildung 3 werden die GTPHydrolyse des Ras-Moleküls und die Beschleunigung durch das GAP gezeigt. Dabei konnte zum ersten Mal ein für die Katalyse wichtiger Zwischenschritt aufgelöst werden [4]. Das Ras-Protein ist über Lipidanker an der Zellmembran gebunden. Mit Hilfe der ATR-Technik (Messung mit abgeschwächter Totalreflexion) konnte Ras in seiner natürlichen Umgebung an einer Lipidmembran FTIR-spektroskopisch untersucht werden [5]. Damit kann jetzt das Interaktionsnetzwerk des Ras-Proteins und der Einfluss von Wirkstoffen auf diese Interaktionen im Detail studiert werden. Könnte man das Interaktionsnetzwerk von onkogen-mutiertem Ras mit kleinen Wirkstoffmolekülen beeinflussen, so wäre dies ein molekularer Ansatz im Rahmen der personalisierten Medizin. Die FTIR-spektroskopische ATRTechnik liefert ein markerfreies Nachweissystem zur Identifizierung von Wirkmechanismen möglicher Leitsubstanzen in der personalisierten Medizin [6]. Die ATR-Technik funktioniert ähnlich wie die Oberflächenplasmonresonanz, engl. Surface Plasmon Resonance (SPR), liefert aber die biochemische Information durch Vibrationsspektroskopie.

Raman-Imaging an lebenden Zellen

Geht man weiter von dem In-vitro-System, einem rekombinanten Protein oder einem mem bran rekonstituierten Protein zu einer lebenden Zelle, muss die Vibrationsspektroskopie anders eingesetzt werden: Bei IR- und Raman-Mikroskopen werden die gesamten biochemischen Eigenschaften ortsaufgelöst jeweils an allen gemessenen Bildpixel-Punkten integral dargestellt. Einzelne Proteine, Lipide oder DNS werden dabei nicht mehr aufgelöst, sondern die Gesamtheit aller Analyten wird gemessen. Man kann also nicht mehr wie in den beiden vorherigen Beispielen im Detail über einzelne Proteine Aussagen treffen, jedoch erhält man ein integrales Bild, einen spektralen Biomarker, der den biochemischstrukturellen Zustand an der gemessen Stelle z.B. einer Biopsieprobe wie einen Fingerabdruck wiedergibt (Abb. 4). Wie bei der Identifikation anhand eines Fingerabdrucks muss eine Datenbank aufgebaut werden, um die spektralen Biomarker als Klassifikator bei der Annotation von Zellkomponenten einsetzen zu können. Die konfokale Raman-Mikroskopie erlaubt dabei zusätzlich verschiedene Schnitttiefen aufzunehmen. Diese lassen sich dann zu einem dreidimensionalen Bild der Zelle zusammensetzen (Abb. 5). Die einzelnen subzellulären Komponenten werden markerfrei simultan erfasst. Durch Einsatz von Infrarot-Mikroskopen lassen sich ganz analog ortsaufgelöste Informationen von Gewebeschnitten erhalten. Mithilfe von Pathologen werden dann diese Indexfarbenbilder durch Vergleich mit klassisch angefärbten Proben annotiert. Multivariate Statistik mit der Verwendung von breiten Spektralbereichen verbessert die Analyse. Am Ende dieser Entwicklung soll mit Hilfe der Vibrationsspektren Gewebe objektiv in einem automatischen Verfahren mit hoher Sensitivität und Spezifität klassifiziert werden. Dies ist uns kürzlich für Darmkrebs-Biopsieproben automatisiert gelungen. Zur Entwicklung dieser Methoden und der Translation in die klinische Forschung ist das europäische Proteinforschungsinstitut PURE mit Unterstützung der NRW-Landesregierung in 2010 gegründet worden.