HPLC-MS - Nachweis von Mykotoxinen

Entwicklung von qualitativen und quantitativen immunodiagnostischen Schnelltests

von Alexandra Molinelli

Mykotoxine können Schäden bei der Lebensmittelgewinnung und -lagerung verursachen. Da Mykotoxine ungleichmäßig in Lebens- oder Futtermittel verteilt sein können, fällt der repräsentativen Probenziehung – zur lebensmittelrechtlichen Beurteilung ganzer Partien – eine zentrale Rolle zu. Aber auch die sich anschließende Probenaufbereitung einschließlich dem Clean-up mittels dispersiver oder Immunaffinitäts-SPE und analytischer
Verfahren stellen hohe Anforderungen an das untersuchende Labor. Zur besseren Vergleich-barkeit der amtlichen Ergebnisse müssen daher die Mindestleistungskriterien der EU- Richtlinien für Probenahme und Analytik erfüllt werden. Die Bestimmung der Mykotoxine erfolgt häufig mittels HPLC – zunehmend in Kombination mit der Massen-spektrometrie (MS oder Tandem MS) – aber auch mittels Verfahren wie Gaschromatographie, Hoch- leistungs-Dünnschichtchromatographie (HPTLC) und Enzymimmunoassays. Nachfolgend ist das Testprinzip eines qualitativen und quantitativen, immundiagnostischen Lateral-Flow-Schnelltestsystems beschrieben – eine ideale Möglichkeit für das Screening von Lebensund Futtermittelproben vor der eigentlichen HPLCAnalyse.

Um hochwertige Nahrungsmittel gewährleisten zu können, ist ein „Vorsorgesystem“ erforderlich. Giftstoffe müssen bereits in der Rohware erkannt werden, damit Maßnahmen getroffen werden können und diese nicht in unsere Nahrungsmittel gelangen. In der Lebensmittelindustrie bedient man sich seit Jahrzehnten einem Vorsorgesystem, dem
sogenannten HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Point). Wird das HACCP-System korrekt eingesetzt, so wird auf eine frühest mögliche Kontrolle der Rohware, der Produktionsumgebung, des Personals usw. fokussiert. Die Risikoanalyse erfordert eine systematische Bewertung der Risiken von mikrobiologischen (Bakterien, Viren), chemischen
(Mykotoxine) und physikalischen (Glas, Plastik) Gefahren.

Die Mykotoxine zählen zu den wichtigsten natürlichen Kontaminanten von Getreide und stellen somit eine chemische Gefahr dar. Die Belastung durch diese Pilz-
Sekundärmetaboliten kann je nach gegebenen Bedingungen, wie z. B. Temperatur und Luftfeuchtigkeit, Insektenbefall und Anfälligkeit der Pflanze, stark schwanken. Weltweit stellt die Kontamination von Lebens- und Futtermitteln mit Mykotoxinen ein Problem
dar. Die UN Food and Agriculture Organization (FAO) schätzt, dass bis zu 25 % der Weltproduktion von Nahrungsmitteln mit Mykotoxinen kontaminiert sind.
In den letzten Jahren wurden in vielen Ländern der Welt Richtlinien und Verordnungen mit Grenzwerten für Mykotoxine erlassen. In den EU-Verordnu ngen EC 1881/2006 und EC 1126/2007 sind Höchstgehalte festgelegt. So darf z. B. unverarbeiteter Durum-Weizen
nicht mehr als 1.250 ppb Deoxynivalenol enthalten. Um diese geringe Menge zu veranschaulichen: 1 ppb entspricht einem Maiskorn in 3,5 LKW-Ladungen, was wiederum die Wichtigkeit des Probenahmeverfahrens für ein reproduzierbares Unter-suchungsergebnis – vor allem in der amtlichen Kontrolle – unterstreicht.

Aufgrund dieser Entwicklung besteht mehr denn je die Notwendigkeit funktionierender Schnelltests, weil eine Vielzahl an Proben untersucht werden muss und bestehende analytische Methoden im Labor oft langwierig und kostenintensiv sind. Streifentests, sogenannte Lateral Flow Devices (LFDs), können direkt vor Ort eingesetzt werden und sind durch die Möglichkeit der qualitativen oder quantitativen Bestimmung eine gute
Alternative, um Kontaminationen von Getreide festzustellen. Streifentests zeigen bereits innerhalb von Minuten ein Ergebnis und haben den Vorteil, dass weder ein speziell eingerichtetes Labor noch Gerätschaften vorhanden sein müssen. Unter bestimmten Bedingungen, beispielsweise zur Überprüfung der Richtigkeit von Ergebnissen, die mit Schnelltestsystemen vor Ort produziert werden, empfiehlt sich die Absicherung mittels
einer Referenzmethode.

Testprinzip

Die Teststreifen bestehen aus einer schmalen ca. 5 mm breiten Nitrozellulose-Membran, die mit Reagenzien imprägniert und auf einer Trägerfolie fixiert ist. Die Reagenzien liegen in trockener und stabilisierter Form vor, deshalb muss das Aufbewahrungsgefäß nach der Entnahme eines Teststreifens möglichst schnell wieder verschlossen werden. Im Schnelltest werden die spezifischen Antikörper-Antigen-Bindungen mithilfe vom
kolloidalem Gold durch die rötliche Färbung der kolloidalen Partikel sichtbar gemacht. Für
die Teststreifen dienen ein Protein-Mykotoxin Konjugat als Testbande und als Kontrollbande ein anti-Spezies Antikörper.
Freie, d. h. nicht mit Toxin aus der Probe beladene, Goldkolloid-Antikörper-Konjugate binden spezifisch an die immobilisierten Protein-Mykotoxin-Konjugate (Testlinie).
Das Goldkonjugat wird auch unspezifisch an die Kontrolllinie gebunden. Diese muss nach der Durchführung des Tests immer sichtbar sein, um die Richtigkeit des Tests zu gewährleisten.

Durchführung

10 g Probe werden mit Methanol:Wasser (70:30, v/v) im Verhältnis 1:4 bzw. 1:5 (w/v) 3 min lang durch Schütteln extrahiert. Der Extrakt wird weiter verdünnt und direkt für den Schnelltest verwendet (50 ?L pro Test). Das Probenfeld des Teststreifens wird anschließend für drei Minuten (Deoxynivalenol) in diese Lösung getaucht.Der Teststreifen wird danach für eine Minute unter Heißluft getrocknet (XDryer, Romer® Labs) und anschließend die Intensität der Färbung der Testlinie mit einem Reflexionsphotometer (XReader, Romer® Labs) ausgewertet. Ein linearer Zusammenhang zwischen der Toxin-Konzentration und der gemessenen Intensität der Testlinie ermöglicht eine quantitative Bestimmung. Bis zu vier Streifen können mit dem XReader simultan gemessen werden. Das etektionssystem ermöglicht die standardisierte Auswertung einzelner Teststreifen und die Verwaltung der Analysedaten inklusive einer Streifentest- Abbildung, die mit einer im XReader integrierten Kamera aufgenommen wird. Kommerzielle Testkits Die AgraStrip® Mykotoxin Tests sind derzeit für Aflatoxin und Deoxynivalenol kommerziell erhältlich (Romer® Labs). Schnelltests für andere Mykotoxine befinden sich gegenwärtig in Entwicklung und werden demnächst verfügbar sein. Der Aflatoxin-Streifentest ermöglicht die qualitative Bestimmung von Aflatoxin B1, B2, G1, und G2 innerhalb von fünf Minuten. Eine negative Probe kann auch nach einer Minute erkannt werden, wenn zwei Linien (Test- und Kontrolllinie) sichtbar werden (*, siehe Abb. 2). Der Streifentest, der mit den drei Cutoff-Werten 4 ppb, 10 ppb, und 20 ppb erhältlich ist, wurde für Mais, DDGS (Dried Distillers Grain and Solubles), Sojabohnen, Baumwollsaat, Erdnüsse, Reis, Mandeln, Pistazien und weitere Rohstoffe validiert. Weiterhin wurde der AgraStrip® Aflatoxin-Test von der japanischen FDA anerkannt und von der amerikanischen USDA/GIPSA (US Department of Agriculture/Grain Inspection, Packers, and Stockyards Administration) als GIPSA-Test zugelassen. Der AgraStrip® Deoxynivalenol Test ist ein quantitativer Test im Bereich zwischen 0.5 und 5.0 ppm DON. Mit nur vier Minuten Testzeit ermöglicht dieser Test die schnellste DON-Bestimmung in Getreide. Der AgraStrip® DON ist bisher für Weizenproben validiert. Weitere Matrices wie z. B. Mais folgen in Kürze.

Zusammenfassung

Es werden immunodiagnostische Tests für den qualitativen oder quantitativen Nachweis von Mykotoxinen in Rohstoffen vorgestellt. Bedingt durch die schnelle Interpretation der Testergebnisse innerhalb von 5 min, finden die entwickelten LFDs im Bereich Monitoring zunehmend Anwendung.

Foto: © Alexandra Molinelli