HILIC - Analyse von Zuckern

Schnelle und hochempfindliche LC/MS-Analyse von Kohlenhydraten

Petrus Hemström und Patrik Appelblad,
Merck SeQuant AB, Umea, Sweden

Die Analyse von Kohlenhydraten in verschiedenen Arten von Formulierungen und Matrices ist für Lebensmittel-, Pharma- und Biotechunternehmen bedeutend. In der Vergangenheit wurden unterschiedliche Analyseverfahren wie Ionenaustausch-, Reversed-Phase (RPC) oder Gaschromatographie benutzt. Nun steht aber ein neues und sensitives Verfahren zur Verfügung.

Hydrophile Interaktionschromatografie

Die hydrophile Interaktionschromatographie (HILIC) ist ein Verfahren zur Trennung von hydrophilen Substanzen wie Kohlenhydrate. HILIC ist einfach durchzuführen und kann erfolgreich dort angewandt werden, wo traditionelle Umkehrphase- Verfahren versagen und weist eine höhere Flexibilität als die Ionenaustauschchromatographie auf. Die Elutionsreihenfolge ist typischerweise umgekehrt zur RPC, bei der zumeist die polaren Substanzen nach den unpolaren Verbindungen eluiert werden. Die gebundene zwitterionische stationäre HPLC-Phase SeQuant™ZIC®-HILIC (Abb.1) erlaubt eine sehr sensitive ESI-MSDetektion, da die die Elution von polaren Substanzen bei einem hohen organischen Anteil in der mobilen Phase erfolgt. Diese zwitterionische stationäre Phase ist in Kieselgel- oder Polymerform erhältlich. Die Polymer-Phase ist bei der Analyse von Kohlenhydraten vorteilhaft, da ihre Selektivität durch Veränderung des pH-Wertes im Bereich von pH 2-10 variiert werden kann. Mit der Kieselgel-Phase kann nur im Bereich pH 3–8 gearbeitet werden.

Basislinien-Trennung in nur 3 Minuten

Mit der polymerbasierten SeQuant™ZIC®- HILIC-Säule und Gradienten-Elution konnte eine Basislinien-Trennung von vier Zucker- Analyten innerhalb von drei Minuten erhalten werden (siehe Abb. 2). In dieser Untersuchung wurden Monosaccharide durch direkte ESI-MS-Detektion bei einem höheren pH-Wert getrennt. Die Modellsubstanzen, Fructose und Saccharose, lassen sich bei allen pH-Werten leicht trennen, während bei Glucose und Lactose bei neutralem pH-Wert Mutarotation auftritt. Der Einsatz von einfachen Puffern in der mobilen Phase (z.B. NH3 aqu.) ist wichtig, um die Bildung von Doppelpeaks durch Anomere zu verhindern. Durch Verwendung einer basischen mobilen Phase können Anomere als einzelne Peaks auf einer polymerbasierten SeQuant™ZIC®- HILIC-Säule eluiert werden, wodurch die Trennung von komplexen Kohlenhydratproben ermöglicht wird. Es wurde eine Gradienten-Elution gewählt, um scharfe Peaks bei kurzer Trennzeit zu erhalten. Die Säulentemperatur von 55°C ermöglicht eine Verminderung der Viskosität des Eluenten und verringert Druckschwankungen im Verlauf des Gradientenprofils.

Bemerkenswert hohe Effizienz und Empfindlichkeit

Auf Basis von Doppelmessungen mit Standards in fünf verschiedenen Konzentrationen wurden lineare Kalibriergeraden zur Ermittlung der Analytkonzentrationen erstellt. Für alle Analyten wurden Kalibriergeraden mit einem Korrelationskoeffizienten e 0,997 erhalten. Die Nachweisgrenzen (Limit of detection, LOD) lagen insgesamt bei 0,2 ppm. Damit sollten Kohlenhydrate mit diesems ESI-MS-Verfahren empfindlicher zu bestimmen sein als mit Lichtstreu (ELSD)- oder Brechungsindex (RI)-Detektion.

Schlussfolgerung

Die chemische Stabilität von polymerbasierten SeQuant™ZIC®-HILIC-Säulen erlaubt eine direkte HPLC-ESI-MS-Quantifizierung von Mono- und Polysacchariden. Werden mobile Phasen bei hohem pHWert benutzt, so ist es möglich, die Mutarotationsrate zu steigern und Anomeren- Peaks zu vermeiden, was die Erkennung von Kohlenhydraten in unterschiedlichen Arten von Proben vereinfacht, sogar bei schwieriger Matrix. In Verbindung mit einfachen Verfahren zur Vorbereitung der Probe wie Proteinfällung oder Flüssig- Flüssig-Extraktion können effiziente und kostengünstige analytische Protokolle entwickelt und zur Prüfung von Zuckern, Alditolen und anderen Kohlenhydraten in verschiedenen Arten von Formulierungen und Matrices benutzt werden.

>> patrik.appelblad@mercksequant.com

Literatur www.sequant.com/sugars