Protein-Elektrophorese – eine Erfolgstory im Wandel der Zeit

Ständig unter Strom

von Dr. Mario Mehmel, Dr. Julia Bauer

Geladene Moleküle wandern durch ein elektrisches Feld. Diese Tatsache bildet die Grundlage der Elektrophorese, einer Technik, die heute in nahezu jedem biologischen Labor angewandt wird und die Grundlage vieler Trenntechniken und analytischer Methoden bildet. Der Biochemiker oder Molekularbiologe verbindet mit dem Begriff Elektro phorese vermutlich unmittelbar die Gelelektrophorese auf Agarose- oder Acrylamidbasis und denkt bei letzterer wahrscheinlich an die SDS-PAGE – eine der am meisten verbreiteten elektrophoretischen Methoden überhaupt . Aber das Feld der Elektrophorese ist sehr viel breiter gefächert und im Gegensatz zu den heutigen domi nierenden supportbasierten Elektrophoresetechniken fanden die ersten vorsichtigen Schritte in Lösung statt.

Wie alles begann ...

Wie und wann genau hat die Erfolgsgeschichte der Elektrophorese begonnen? Die grundlegende Theorie ist mehr als 200 Jahre alt, aber erst in den 1930erJahren entwickelte der Schwede Tiselius die „moving boundary electrophoresis“, also die Elektrophorese der „wandernden Grenzflächen“. Diese in freier Lösung durchgeführte Elektrophorese eignete sich zur Untersuchung der Mobilität gela dener Teilchen und wurde in einem eigens dafür entwickelten „Tiselius Apparat” durchgeführt . Die durch das elektrische Feld erzeugten „moving boundaries” auswandernden Proteinen wurden mithilfe von Absorptionsänderungen oder Änderungen im Brechungsindex bestimmt. Dabei war die Analyse auf die am schnellsten und die am langsamsten wandernde Fraktion beschränkt: Anders als heute war eine komplette Auftrennung des Proteingemischs mit dieser Methode nicht möglich; egal, wie lange die Moleküle auch wanderten, eine vollständige Entmischung wurde niemals erreicht.
In den 1950erJahren drängte sich langsam die Zonenelektrophorese in den Vordergrund und Tiselius’ Grenzflächenelektrophorese verlor immer mehr an Popularität. Das Prinzip der Zonenelektrophorese wurde erstmalig 1939 beschrieben und unterscheidet sich deutlich von dem der Grenzflächenelektrophorese: Mittels Zonenelektrophorese lassen sich Proteine, Nukleoside, Aminosäuren und andere gelade ne Moleküle sauber voneinander trennen. Das Geheimnis liegt in der Verwendung eines Supportmediums, das dem Sedimentieren der Moleküle entgegenwirkt. Zunächst bediente man sich einfachen Filterpapiers; aber die Methode konnte durch den Einsatz von Cellulose acetat (Kohn 1957), Stärke (Smithies 1955), Polyacrylamid (Raymond & Weintraub 1959) und Agarose (Hjertén 1961) noch deutlich verbessert werden.

Die Entdeckung der PAGE – Sturm und Drang

Die 1960erJahre leiteten eine neue Ära der Elektrophorese ein. Die Zeit war geprägt von der Einführung neuer Techniken sowie der fortschreitenden Verbesserung bereits existierender Methoden. Die DiscElektrophorese wurde entwickelt, ebenso die isoelek trische Fokussierung, der Triphenylmethanfarbstoff Coomassie® Brilliant Blue wurde erstmals verwendet, um Proteine im Gel sichtbar zu machen. Außerdem zeigte sich, dass das Detergenz SDS hervorragend dazu geeignet ist, die Nettoladung von Proteinen während der PolyacrylamidElektrophorese zu maskieren. In der resultierenden SDSPAGE ist der Trennprozess nicht länger von der proteinspezifischen Nettoladung, sondern dem unterschiedlichen Molekulargewicht abhängig.
5 Jahre, nachdem Raymond & Weintraub Polyacrylamid erstmals als Supportmaterial für die Elektrophorese vorgestellt haben, wird das Polymer von Ornstein und Davis in eine Technik integriert, die bis heute in nahezu jedem biochemischen und biologischen Labor praktiziert wird: 1964 entwickelten sie die diskontinuierliche (Disc) Elektrophorese, die zwei elektrophoretische Prinzipien vereint: Zonenelektrophorese und Isotachophorese. Mithilfe der Isotachophorese – zunächst als „ion migration method” (Kendall & Crittenden 1923) oder auch „displacement electrophoresis” (Martin 1942) bezeichnet – lassen sich scharfe Grenzen zwischen den einzelnen Probenbestandteilen erzeugen. Im Gegensatz zur Zonenelektrophorese wird die Isotachophorese in einem diskontinuierlichen Puffersystem durchgeführt, bestehend aus einem leadingElektrolyten von sehr hoher elektrophoretischer Mobilität und einem sehr langsam wandernden terminatingoder trailingIon. Nach dem Anlegen des elektrischen Feldes wandern die Probenmoleküle gemäß ihrer spezifischen Mobilität unterschiedlich schnell und bilden eng aneinanderliegende Schichten („stacks“) aus. Das Molekül mit der höchsten Mobilität folgt dabei unmittelbar auf das leadingIon, während das Molekül mit der niedrigsten Laufgeschwindigkeit direkt vor dem terminatingIon läuft. Soweit kein Zauberwerk. Sobald die Trennung komplett ist, bewirkt jedoch das schneller laufende Molekül eine Abschwächung des umgebenden elektrischen Feldes, während das langsamer wandernde Molekül dieses stärkt bzw. erhöht. Folglich wandern nun alle Moleküle gleich schnell (Isotachophorese bedeutet wörtlich „Wanderung mit gleicher Geschwindigkeit“): Die vorher schnelleren Moleküle werden durch das umgebende schwache Feld gebremst, während gleichzeitig die zunächst langsameren Moleküle durch das gestärkte Feld beschleunigt werden. Dieses Phänomen führt zu einem sich selbst schärfenden Effekt; sobald ein Molekül aus der eigenen Bande hinausdiffundiert, wird es durch das 45 äußere Feld durch Beschleunigung oder Abbremsung in dieses zurückgezwungen. Doch wieder zum Prinzip der Discelektrophorese. Durch die Verwendung zweier unterschiedlicher Trennungsbereiche (Sammelund Trenngel) in Kombination mit einem diskontinuierlichen Puffer system gelingt es Ornstein und Davis zum einen, der Formation von Proteinaggregaten während des Eintritts in die Gelmatrix vorzubeugen und zum anderen, die Trennung des Probengemischs in wohl definierte und deutlich voneinander separier te Banden zu meistern.
Die Gele enthalten ausschließlich Chlorid ionen (mit Tris als Gegenion), wohingegen der Elektrophoresepuffer Glycin enthält. Die Proteine werden zunächst im Sammelgel nach dem Prinzip der Isotachophorese gemäß ihrer elektrophoretischen Mobilität in engen Schichten konzentriert angeordnet. Aufgrund der größeren Poren des Sammelgels wird die Mobilität der nativen Proteine nicht durch ihre Größe beeinflusst. Da die Nettoladung von Glycin durch den niedrigeren pHWert des Sammelgels praktisch null ist, fungiert Glycin hier als terminatingIon. Sobald die Proteinfront die Grenze zum engerporigen Trenngel erreicht, gelingt es dem kleinen Glycin, die Proteinbanden zu durchdringen und die Trenngelregion mit dem etwas höheren pHWert zu passieren. Es wandert nun gemeinsam mit den Chloridionen vor den folgenden Proteinfraktionen. Sobald die Proteine wiederum von einem homogenen Puffer umgeben sind, beginnen sie sich nach dem Prinzip der Zonenelektrophorese aufzutrennen: Ihre Mobilität hängt nun von ihrer Ladung UND ihrer Größe ab; diese Änderung im Trennprinzip führt zu einer Neusortierung der Proteinreihenfolge im Gel.
Als Laemmli im Jahre 1970 seine berühmte Veröffentlichung über die Trennung von T4- Phagenproteinen publiziert, hatte er das von Ornstein und Davis entwickelte Tris-Glycin-Chlorid-Puffersystem verwendet. Anstatt jedoch eine „native” PAGE wie diese durchzuführen, setzt Laemmli seinemGel das Detergenz SDS zu, das erstmals von Shapiro et al. 1967 in der PAGE verwendet wurde. Bis heute ist die SDSPAGE mit „Laemmli”-Puffer die am häufigstenverwendete Technik für die Trennung von Proteingemischen.
Eine deutliche Verbesserung des Proteinnachweises in Acrylamidgelen (besondersfür die 2D-Elektrophorese) brachte die Einführung der empfindlichen Silberfärbung, eine Technik, die 1979 von Merrill et al. entwickelt wurde. Verglichen mit der bis dahin vorherrschenden Coomassie®- Färbung konnte die Nachweisgrenze durch diese Technik vom Mikrogramm- in den Nanogrammbereich verfeinert werden. Im selben Jahr führten Towbin et al. den ersten Western Blot durch; sie übertrugen mittels SDS-PAGE aufgetrennte Proteine auf eine Nitrocellulosemembran.

SDS-PAGE: Kommt da noch irgendwas nach Laemmli?

Die durch Laemmli geprägte Ausführung der SDS-PAGE ist bis heute absolut präsent und es drängt sich die Frage auf, ob es nach Laemmli keine weiteren Entwicklungen mehr gab. Keine alternative Techniken oder Verbesserungen während der letzten 40 Jahre? Nicht ganz!
Einige Proteinklassen zeigen ein anormalesoder zumindest unerwartetes Verhalten in der SDS-PAGE; darunter Glycoproteine, stark basische Proteine (positivgeladen) und einige hydrophobe Transmembranproteine. Hinsichtlich der extrem hydrophilen Glycoproteine bietet der Wechsel zu alkalischem Tris-Borat-EDTA Puffer (Poduslo 1981) eine deutliche Verbesserung. Um Histone aufzutrennen, entwickeln Panyim und Chalkley 1969 spezielle Harnsäure-Polyacrylamidgele (acid urea, AU-Gele). Eine weitere Alternative ist das TAU-Gel, das zusätzlich das nichtionische Detergenz Triton® enthält. TAU-Gele eignen sich besonders für die Identifizierung von Proteinmodifikationen wie Acetylierungen und Phosphorylierungen. Andere stark geladene Proteine lassen sich ihrer Größe nach auftrennen, wenn man anstelle von SDS das kationische Detergenz Cetyltrimethyl- ammoniumbromid verwendet (Eley et al. 1979).
Um eine bessere Trennung kleiner Peptidezu erreichen, nutzten Schägger & Jagow 1987 alternativ ein Tris-Tricin-Puffersystem für die SDS-PAGE. Vier Jahre später stellen die beiden ein diskontinuierliches Elektrophoresesystem für die Isolation von Membranproteinen aus Acrylamidgelen vor. In ihrer „blue native” Elektrophorese, wird durch Coomassie® anstelle von SDS ein Proteinladungsshift induziert. Zusätzlich dienen Aminocapronsäure und nichtionische Detergenzien wie Triton® X-100 einer verbesserten Solubilisierung der Membranproteine. Die resultierenden Farbstoff- Detergenz-Protein-komplexe werden in einer Aminocapronsäurehaltigen PAGE getrennt und anschließend – für Untersuchungen bezüglich ihrer Quartärstruktur – mittels Tricin-SDS-PAGE in die einzelnen Polypeptide aufgelöst. Bei kleineren Membranproteinen wird vorgeschlagen, Coomassie ® gegen Taurodeoxycholat auszutauschen.

Darf’s ein bisschen weniger sein – oder: allem Einfachen wohnt ein Zauber inne

2001 haben Ahn et al. eine vereinfachte Varianteder SDS-PAGE vorgestellt: Das so genannte „Single Gel“ besteht nur aus einem Trenngel mit relativ längerer Laufstrecke. Während im Laemmli Tris-Glycin- Gel nur eine Aminosäure als langsam laufendes Ion fungiert, erfüllen im Ahn-Gel Glycin, Serin und Asparagin diesen Zweck. Laemmli-Gele arbeiten bei pH-Wert 8,8, dagegen arbeiten Ahn-Gele bei pH 7,4, was sich positiv auf die Stabilität und Haltbarkeit der Gellösung auswirkt. Denn bei diesem milden pH-Wert ist die Hydrolyse von Acrylamid minimal. Ahn Gele enthalten außerdem kein Detergenz, für denaturierende Bedingungen wird einfach dem Laufpuffer SDS zugesetzt.
In der Originalarbeit von Ahn et al. wurde kein Vergleich mit Laemmlis SDS-PAGE vorgenommen. Wir wollten deshalb die Unterschiede zwischen Ahn- und Laemmli- Gelen näher untersuchen. Zu diesem Zweck haben wir Proteinproben auf 10 %-Acrylamid-Gelen nach beiden Protokollen getrennt. Zusätzlich haben wir den Proteintransfer auf Blottingmembranen im Western-Blot untersucht. Unsere Ergebnisse in Kürze:

1. Elektrophorese.

Der erste deutliche Unterschied zwischen Ahn- und Laemmli-Gelen ist die Länge des jeweiligen Trenngels bei gleichen Gel- Kassetten. Ahn-Trenngele haben die längere Laufstrecke (Abb. 1). Das Wanderungsverhalten von Proteinen mit unter- schiedlicher Molekularmasse unterscheidet sich allerdings bei den beiden Gel-Typen. Auf Laemmli-Gelen werden Proteine von 15 – 70 kilo Dalton (kD) am besten getrennt. Dagegen zeigen Proteine mit Massen von 25 – 130 kD auf Ahn-Gelen eine lineare Auftrennung. Für die Trennung von Proteinproben mit vielen unterschiedlichen Proteingrößen auf ein und demselben Gel kann man deshalb sagen: Ahn-Gele sind besonders für Proteine mit mittleren und hohen Molekularmassen geeignet. Bei derselben Konzentration an Acrylamid-Polymer sind Laemmli-Gele besser im Bereich von kleinen bis mittelgroßen Proteinen.

2. Stabilität.

Wir haben außerdem auch die Stabilität von Acrylamid-Lösungen nach Ahn und Laemmli untersucht und diese dafür bis zu sechs Monate bei 4 °C gelagert und anschließend getestet. Polyacrylamid-Gele, die aus so gelagerten Lösungen hergestellt wurden, zeigten keine signifikanten Unterschiede in ihrer Qualität. Polymerisierte Gele sollten aber immer innerhalb von wenigenTagen verwendet werden, da sich der pH-Wert in solchen Gelen sehr schnell verändert. Das gilt gleichermaßen für Laemmli- und Ahn-Gele.

3. Western-Blot.

Wir konnten feststellen, dass der Transfer unterschiedlich gut gelingt, abhängig von der Größe der Proteine (Abb. 2). Tubulin, ein 66 kD-Protein, wurde von Laemmli- Gelen im Vergleich zu Ahn-Gelen zu 55 % weniger auf die Membran übertragen. Dagegen war der Transfer eines 25 kD His-tag Proteins von Ahn-Gelen um 32 ± 12 % schlechter (n = 4). Insgesamt empfehlen sich Laemmli-Gele für den Transfer von Proteinen mit kleiner Masse, während sich Ahn-Single-Gels für Western-Blots von Proteinen mit höherer Masse besonders gut eignen.

4. Handhabung.

Befragte Anwender mochten das schnelle, einfache Protokoll nach Ahn et al. Das System lässt sich leicht in Laboren umsetzen, die bereits die „klassische“ Laemmli-Methode verwenden. Denn alle Geräte und die meisten Lösungen sind die gleichen für beide SDS-PAGE-Protokolle.
Auch andere, zunächst skeptische Autoren haben mittlerweile das Single Gel- Systemnach Ahn et al. erprobt und die guten Ergebnisse bestätigt. In Rehm (2007) nennt G. Fritz (Univ. Zürich) zusätzliche positive Eigenschaften der Ahn-Gele: 1. sie laufen eher gerade (bilden keine „Smilies“), 2. Ahn-Gele funktionieren bei höheren Polyacrylamid- Konzentrationen, 3. das unschöne, weil schleimige Sammel-Gel wird umgangen.
Die vielen guten Erfahrungen, die Anwender mit den Ahn-Single-Gelen gemacht haben, das zeitsparende Protokoll und die Anwenderfreundlichkeit haben uns bei AppliChem dazu bewogen, Fertig- Gellösungen nach Ahn et al. anzubieten. Mit der Verwendung der gebrauchsfertigen AppliChem-Lösungen ist es möglich, eine SDS-PAGE in nur 15 Minuten startklar zu machen.

Die Zukunft?!

Immer neu entwickelte Methoden erlaubendie Gewinnung ständig neuer Erkenntnisse in den Naturwissenschaften. Methoden wie die Gel-Elektrophorese haben viele Jahre überdauert. Ursprüngliche Protokolle werden ständig verbessert, angepasst und neue Eigenschaften werden eingebracht. AppliChem ist stets bestrebt, verbesserte Anwendungen zu entdecken und unseren Kunden viel versprechende Produkte anzubieten.

Literatur

[1] Everaerts, F.M., Becker, J.L., & Verheggen, T.P.E.M. (1976) “Isotachophoresis: Theory, Instrumentation, and Applications”; Elsevier, Amsterdam
[2] Michov, B. (1995) „Elektrophorese: Theorie und Praxis“; Walter de Gruyter & Co, Berlin
[3] Vesterberg, O. (1993) “A short history of electrophoretic methods”; Electrophoresis, 14, 1243-1249
[4] Righetti, P.G. (2005) “Electrophoresis: The march of pennies, the march of dimes”; Journal of Chromatography A, 1079, 24-40
[5] Westermeier, R. (2004) “Electrophoresis in Practice: A Guide
to Methods and Applications of DNA and Protein Separations”; 4th ed. Wiley-VCH, Weinheim