Essenzielles Tool für Design moderner Biomaterialien und Drug Delivery Systeme

Der Schlüssel zum Körper

von Dr. Cornelia Keck, Prof. Dr. Rainer Müller, Prof. Dr. med. Karl-Herbert Schäfer, Markus Klotz

Wenn die Oberfläche eines Biomaterials in Kontakt mit Körpergewebe/- flüssigkeit kommt, so lagern sich an diese Oberfläche Körperproteine an. Art und Zusammensetzung dieser Adsorptionsschicht bestimmen, ob der Körper unverträglich reagiert oder das Material „akzeptiert“ (= Biokompatibilität). Diese Proteine bestimmen auch die Verteilung von Nanomaterialien im Organismus.

Wechselwirkung korpereigener Proteine mit Biomaterialien

Eine Vielzahl von fremden Materialien wird heute in den menschlichen Körper eingebracht. Dies reicht von Zahnersatz über künstliche Hüftgelenke und Herzklappen bis hin zu modernen Arzneistoffabgabesystemen (Drug Delivery Systeme, DDS). Voraussetzung für die Anwendung ist, dass die Materialien „biokompatibel“ sind (gr. bios = Leben, kompatibel = verträglich). Biokompatible Materialien haben keinen negativen Einfluss auf den Organismus, sie sind mit dem sie umgebenden Gewebe verträglich. Was bestimmt nun, ob ein Material biokompatibel ist? Die Verträglichkeit wird einerseits von der Art des Materials bestimmt (ob es z.B. unerwünschte, pH-verschiebende Substanzen in das umgebende Gewebe freisetzt, Quecksilber aus Amalgamfüllungen etc.) und andererseits von den Oberflächeneigenschaften (funktionelle Gruppen, Hydrophobie, Ladung etc). Diese Oberflächeneigenschaften bestimmen, welche Proteine (qualitativ) und in welcher Konzentration (quantitativ) sich an der Oberfläche anlagern. Dieses entstehende Proteinadsorptionsmuster bestimmt die Verträglichkeit. So können angelagerte „Opsonine“ Makrophagen „anlocken“ und somit entzündliche Reaktionen stimulieren. Angelagerte „Dysopsonine“ wie Serumalbumin gestalten eine mehr physiologische, verträgliche Oberfläche. Sie bilden quasi eine „Proteintarnkappe“ um ein körperfremdes Material. So werden Nanopartikel mit diesem „stealth effect“ von den Makrophagen nicht erkannt (analog dem amerikanischen Stealth Tarnkappenbomber, der dem Radar entgeht).

Design durch Kontrolle des Proteinadsorptionsmusters

Mit diesem Wissen können nichtbiokompatible Werkstoffe in biokompatible Materialien überführt werden, indem man sie mit einer biokompatiblen Proteinschicht überzieht. Besonders elegant ist, wenn man nicht diese Schicht vorher aufzieht, sondern sie sich im Organismus von selbst bildet. Dies kann man dadurch erreichen, indem man die physikochemischen Parameter der Materialoberfläche kontrolliert so gestaltet, dass die Adsorption unerwünschter Proteine verhindert und die Adsorption der „guten“ Proteine primär stattfindet (sog. präferenzielle Adsorption [1]). Die Voraussetzung dafür besteht darin, dass man die Korrelation zwischen den physikochemischen Eigenschaften und dem resultierenden Proteinadsorptionsmuster kennt. Grundlage für die Etablierung dieser Korrelation ist eine hochauflösende Proteinanalytik, da z.B. mehrere tausend Proteine im Blut und den Körperflüssigkeiten zu finden sind. Das inzwischen klassische Verfahren zur Identifizierung der Proteine ist die 2-D Polyacrylamidgelelektrophorese (2-D PAGE, 2-DE [2]), zu den neuesten Technologien gehört DIGE [3,4].

DIGE : differential-in-gel-electrophoresis

Bei der klassischen 2D-Elektrophorese (2-DE) werden die zu vergleichenden Proben jeweils in separate Gele getrennt. Dies bedeutet eine Schwankung der Bedingungen, was dazu führen kann, dass repräsentative Proteinspots nicht exakt gleich abgebildet werden. Eine Evaluierung ist damit deutlich erschwert. Man hilft sich damit die Gele mehrfach zu wiederholen und lässt Referenzproteine mit bekannten Eigenschaften mitlaufen. Anhand dieser Markerproteine und der entsprechenden Software lassen sich dann die Einzelspots zurückrechnen. Dieses Verfahren ist zeitaufwändig und fehlerbehaftet, fordert darüber hinaus einen hohen Probeneinsatz. Die DIGE-Technologie erleichtert die Analyse und erlaubt den Ausschluss von Streuungsparametern alleine dadurch, dass die Proben unter exakt den gleichen Bedingungen untersucht werden. Dies wird erreicht, indem die zu vergleichenden Proben mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen gelabelt werden und dann zusammen im selben Gel getrennt werden. Jeweils zwei Proben sind auf einem Gel und nicht auf verschiedenen Gelen wie bei der 2-DE. Anschließend können die individuellen Proben anhand der unterschiedlichen Fluoreszenzmarkierung mithilfe eines Fluoreszenzscanners ausgelesen werden. Probe 1 wird rot „gelabelt“ und Probe 2 grün. Das Zusammenführen beider Bilder führt zu einem überlagerten, „gemergten“ Bild, in dem alle Proteine, die in beiden Proben identisch sind, als gelbe Spots erscheinen. Ein dritter Farbstoff, hier Blau, wird genutzt, um einen Mix gleicher Mengen der Proben 1 und 2 zu färben. Diese Mischung dient als interner Standard im Gel. Dadurch können Variationen in der Proteinkonzentration und der Farbstoffintensität berechnet und ausgeglichen werden. Der komplette Scan beinhaltet dann einen roten, grünen und einen blauen Kanal. Die Auswertung erfolgt nicht per Auge, sondern mit einer komplexen Software (DeCyder,GE), welche die entsprechenden Spots diskriminiert und hinsichtlich des Expressionsunterschiedes darstellen kann. Die differenziell exprimierten Proteine eines Experiments oder einer Untersuchung lassen sich dann grafisch darstellen. Relevante Spots werden computergesteuert mit einem Spotpicker automatisch dem Gel entnommen und können für eine Identifikation der Massenspektrometrie zugeführt werden.

Anwendungsperspektiven – z.B. GPS fur Nanotaxis zum Wirkort

Über eine hochauflösende Analytik der Proteinadsorptionsschichten kann man Biomaterialoberflächen physiko-chemisch optimieren, um beste Verträglichkeit und Effizienz im Organismus zu erzielen. Sie ist ein essenzielles Tool in der Entwicklung verbesserter und in den Körper eingebrachter Materialien wie Implantate, aber auch Nanoträger für Arzneistoffe [1]. Gerade bei den pharmazeutischen Nanoträgern kann man nicht nur die Gewebeverträglichkeit optimieren, sondern über angelagerte Körperproteine die Nanoträger gezielt zum gewünschten Wirkort leiten, quasi das GPS-System für Nanoträger. Am Wirkort laden die Nanoträger dann den Wirkstoff ab. Die Konzentrierung am Wirkort erhöht die Therapieeffizienz und reduziert die Nebenwirkungen im restlichen Körper.

Wie genau funktioniert es?

Nach intravenöser Injektion von Nanoträgern (z.B. Liposomen, Polymernanopartikel, Nanokristalle) adsorbieren diese an ihrer Oberfläche Proteine aus dem Blut. Art und Konzentration der adsorbierten Proteine bestimmen, von welchen Zellen die Nanoträger bei ihrer Wanderung durch den Blutkreislauf aufgenommen werden. Die Anlagerung von Opsoninen führt z.B. zur Aufnahme von Makrophagen der Leber und Milz oder zur Anlagerung von Apolipoprotein E zum Transport von Arzneistoff ins Gehirn. Auch ist selektive Anreicherung im Knochenmark möglich. Der Trick ist nun, dass man die Oberflächeneigenschaften der Nanoträger so einstellt, dass sie nach i.v.- Injektion automatisch die richtigen Proteine für die Bindung an die gewünschten Zielzellen im Körper anlagern.

Ausblick

Proteine spielen eine immer wichtigere Rolle in unserem Leben – in sehr unterschiedlichen Bereichen von Biomaterialien zur Anwendung im menschlichen Körper über verbesserte Therapiesysteme bis zur Proteomik [3,4]. Proteine sind auch Arzneistoffe, viele der neu zugelassenen Arzneimittel sind heutzutage „Biologicals“. In all diesen unterschiedlichen Bereichen ist hochauflösende, präzise Proteinanalytik eine essenzielle Voraussetzung für erfolgreiche
Entwicklungen.

ck@ckc-berlin.de
nanoteam@gmx.com

Literatur

[1] Müller R.H., Keck C.M., (2004) Challenges and solutions for the delivery of biotech drugs - a review of drug nanocrystal technology and lipid nanoparticles, J Biotechnol 113 (1-3), 151-170
[2] Jansch M., Keck C.M., (2009) Proteinanalytik mit 2-D PAGE. In: Keck CM, Müller RH: Moderne Pharmazeutische Technologie, www.pharmazielehrbuch.de, pp 62-66
[3] Hagl C.I., Thil O., Holland-Cunz S., Faissner R., Wandschneider S., Schnolzer M., Lohr M., Schäfer K-H., (2005) Proteome analysis of isolated myenteric plexus reveals significant changes in protein expression during postnatal development, Auton Neurosci 122 (1-2), 1-8
[4] Hagl C.I., Klotz M., Wink E., Kränzle K., Holland-Cunz S., Gretz N., Diener M., Schäfer K-H., (2008) Temporal andregional morphological differences as a consequence of FGF-2 deficiency are mirrored in the myenteric proteome, Pediatr Surg Int 24 (1), 49-60