Mikrobielle Proteomik
Mikrobielle ProteomikProteine sind die „Akteure des Lebens“, die grundlegende zelluläre Funktionen vermitteln und regulieren. Zudem stellen sie vielfach direkte Angriffspunkte antimikrobieller Wirkstoffe dar. Die Analyse aller Proteine eines biologischen Systems (Proteomik) leistet einen unverzichtbaren Beitrag zu zentralen Themen der mikrobiologischen Forschung, darunter die Aufklärung molekularer Grundlagen bakterieller Infektionen, die Charakterisierung von Wirts-Pathogen- Interaktionen oder Untersuchungen zum Beitrag von Mikroorganismen zu komplexen Umweltprozessen. Mikrobielle Proteomik – eine unverzichtbare Disziplin der mikrobiellen Forschung Die exponentiell wachsende Zahl an Genomsequenzen hat die mikrobielle Forschung im wahrsten Sinne des Wortes revolutioniert. Die Entschlüsselung der Genomdaten stellt jedoch nur einen ersten Schritt zum umfassenden Verständnis von Physiologie und Verhalten von Mikroorganismen dar. Die funktionelle Genomik hat sich deshalb zum Ziel gesetzt, reinen Sequenzinformationen biochemische, physiologische, evolutionäre und ökologische Funktionen zuzuweisen. Eine zentrale Disziplin der funktionellen Genomik ist die Proteomik, die die Analyse aller Proteine einer Zelle, eines Organismus oder eines gesamten Habitats, die zu einem bestimmten Zeitpunkt und/oder unter bestimmten Bedingungen exprimiert werden, umfasst. Eine typische Proteomanalyse beginnt mit der Extraktion von Proteinen aus Mikroorganismen, infiziertem Gewebe oder Umweltproben. Daran anschließend wird das komplexe Proteingemisch aufgetrennt. Lange Zeit wurde hierzu fast ausschließlich die zweidimensionale Gelelektrophorese verwendet; in jüngster Zeit kommen hingegen vermehrt gelfreie Techniken (z.B. multidimensionale Flüssigchromatografie) zum Einsatz. Zur Identifizierung werden die aufgetrennten Proteine enzymatisch in Peptide gespalten, deren Masse und Aminosäure-Zusammensetzung mithilfe modernster Massenspektrometrieverfahren bestimmt werden. Zur Proteinquantifizierung werden heute vor allem gelfreie labelbasierte oder labelfreie Verfahren verwendet. In der Regel werden die globalen Daten schließlich mittels komplementierender Methoden, z.B. reverser Genetik oder phänotypischer Essays, validiert. Pathoproteomik – was steuert mikrobielle Pathogenität?
Globale Genregulation ermöglicht es Bakterien, ihr Expressionsprofil wechselnden Bedingungen, wie sie z.B. bei der Besiedelung von Wirtsorganismen auftreten, anzupassen. Eines der Regulationssysteme, das umfassende Änderungen der Genexpression kontrolliert, ist die bakterielle Zell-Zell-Kommunikation, auch als Quorum Sensing (QS) bezeichnet. QS befähigt Bakterien ihre eigene Populationsdichte wahrzunehmen und bestimmte Gene in Abhängigkeit von der Zelldichte zu exprimieren. Wir arbeiten seit einigen Jahren an der molekularen Charakterisierung der QS-Systeme verschiedener Gramnegativer, opportunistisch pathogener Organismen, darunter Pseudomonas aeruginosa und Burkholderia cenocepacia [1]. Beide Organismen sind können lebensbedrohliche Lungeninfektionen bei Mukoviszidose-Patienten verursachen; P. aeruginosa ist zudem ein gefürchteter Auslöser nosokomialer Infektionen. Durch einen Vergleich Insitu Proteomik – wie verhalten sich Krankheitserreger unter infektionsrelevanten Bedingungen? 80 % aller mikrobiellen Infektionen des menschlichen Körpers sind eng mit der Ausbildung von Biofilmen, die eine enorme Resistenz gegenüber traditionellen antimikrobiellen Wirkstoffen aufweisen, verknüpft. Die Entschlüsselung grundsätzlicher Prinzipien der Biofilmentwicklung ist daher ein wesentlicher Schritt auf dem Weg zu einem umfassenden Verständnis pathogener Bakterien. Proteomstudien wurden bislang zumeist an Mikroorganismen durchgeführt, die im Labor unter definierten Bedingungen angezogen wurden, was in der Regel wenig mit den Bedingungen, die während einer Infektion herrschen, zu tun hat. Um dem entgegenzuwirken, haben wir kürzlich in-situ-Proteomanalysen von P. aeruginosa in zwei verschiedenen Pathogenitätsmodellen (Caenorhabditis elegans & Maus) etabliert. Diese Untersuchungen ermöglichen die Identifizierung von mikrobiellen Virulenzfaktoren, die spezifisch während des Infektionsprozesses exprimiert werden und die Analyse von Veränderungen im Wirtsproteom, die durch die Anwesenheit der Bakterien hervorgerufen werden. Langfristig sollen die in-situ-Proteomanalysen im Rahmen einer Kooperation mit Prof. Michael Givskov von der Universität Kopenhagen und Prof. Leo Eberl von der Universität Zürich zur Validierung der Wirkweise und Spezifität so genannter „linked multi-drugs”, die mehr als eine Zielstruktur innerhalb der Bakterienzelle angreifen, eingesetzt werden. Metaproteomik – ein neuer Weg zum Verständnis pathogener Biofilme Blasenkatheter, die bei verschiedenen Indikationen (z.B. nach Operationen) und in der Langzeitpflege eingesetzt werden, stellen eine ideale Brutstätte für Biofilme uropathogener Bakterien dar. Diese Biofilme sind aufgrund rasch aufkeimender Antibiotikaresistenzen schwer zu bekämpfen und treten schließlich persistent oder gar chronisch auf. Derzeit müssen Katheter nach spätesten 4 Wochen erneuert werden, was sowohl für die Patienten als auch für das Pflegepersonal eine erhebliche Belastung darstellt. Man ging bisher davon aus, dass Katheter-Biofilme von einzelnen Pathogenen, darunter P. aeruginosa, Escherichia coli und Enterococcus faecalis, dominiert werden. Jüngste Untersuchungen haben jedoch gezeigt, dass Katheterbiofilme hoch komplex sind und aus vielen verschiedenen Spezies bestehen. Im Rahmen des vom BMBF geförderten UroGenOmics Konsortiums untersuchen wir regulatorische und metabolische Strategien uropathogener Mikroorganismen. Derzeit analysieren wir Zusammensetzung und Funktionen gemischter Katheterbiofilme mittels so genannter Metaproteomanalysen, die es uns erlauben, die Gesamtheit aller Proteine der mikrobiellen Gemeinschaft auf den Kathetern, aber auch menschliche Proteine zu erfassen. Dabei interessieren uns insbesondere zeitliche und räumliche Veränderungen, stammspezifische Strategien zur Anpassung an spezielle Bedingungen im Harntrakt und Abwehrstrategien des menschlichen Immunsystems. Das hierbei gewonnene Wissen soll dazu bei tragen, alternative Angriffspunkte für Pharmaka zu identifizieren, neue diagnostische Werkzeuge zu entwickeln und biofilmabweisende Katheteroberflächen zu designen. Umweltproteomik – das „Who is Who“ mikrobieller Ökosysteme Mikroorganismen leisten einen wesentlichen Beitrag zu biogeochemischen Kreisläufen, da sie alle natürlichen Polymere abbauen und dadurch langfristig Biosphäre und Klima beeinflussen. Die rapide zunehmenden Sequenzinformationen verschiedenster Habitate sowie die enormen Fortschritte im Bereich der Proteinanalytik und Bioinformatik eröffnen faszinierende neue Möglichkeiten zur Untersuchung der molekularen Grundlagen komplexer Umweltprozesse. Die Analyse aller aus einem bestimmten Ökosystem isolierten Proteine (die so genannte „Umweltproteomik“) ermög licht erstmals die Verknüpfung von Struktur und Funktion mikrobieller Gemeinschaften in der Umwelt [4]. Im Fokus eines interdisziplinären Verbundprojektes mit mehreren Wiener Forschungsgruppen untersuchen wir, inwieweit die biogeochemische Zusammensetzung des Bodens und die klimatischen Verhältnisse verschiedener Standorte die Struktur mikrobieller Gemeinschaften sowie deren metabolische Aktivitäten beim Abbau von hochmolekularen organischen Substanzen im Laub beeinflussen. Mithilfe von Proteomanalysen konnte gezeigt werden, dass Pilze die Hauptabbauleistung bei der Mineralisierung von Laub erbringen, während Bakterien lediglich als Nutznießer fungieren und von den Abbauprodukten der Pilze profitieren [5]. Ähnliche Analysen werden derzeit verwendet, um symbiotische Interaktionen in Flechten aufzuklären und die molekulare Grundlage der Virulenz bestimmter pflanzenpathogener Pilze zu untersuchen.
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L&M 3 / 2011Das komplette Heft zum kostenlosen Download finden Sie hier: zum Download Der Autor:Weitere Artikel online lesenNewsSchnell und einfach die passende Trennsäule findenMit dem HPLC-Säulenkonfigurator unter www.analytics-shop.com können Sie stets die passende Säule für jedes Trennproblem finden. Dank innovativer Filtermöglichkeiten können Sie in Sekundenschnelle nach gewünschtem Durchmesser, Länge, Porengröße, Säulenbezeichnung u.v.m. selektieren. So erhalten Sie aus über 70.000 verschiedenen HPLC-Säulen das passende Ergebnis für Ihre Anwendung und können zwischen allen gängigen Herstellern wie Agilent, Waters, ThermoScientific, Merck, Sigma-Aldrich, Chiral, Macherey-Nagel u.v.a. wählen. Ergänzend stehen Ihnen die HPLC-Experten von Altmann Analytik beratend zur Seite – testen Sie jetzt den kostenlosen HPLC-Säulenkonfigurator!© Text und Bild: Altmann Analytik ZEISS stellt neue Stereomikroskope vorAufnahme, Dokumentation und Teilen von Ergebnissen mit ZEISS Stemi 305 und ZEISS Stemi 508ZEISS stellt zwei neue kompakte Greenough-Stereomikroskope für Ausbildung, Laborroutine und industrielle Inspektion vor: ZEISS Stemi 305 und ZEISS Stemi 508. Anwender sehen ihre Proben farbig, dreidimensional, kontrastreich sowie frei von Verzerrungen oder Farbsäumen. © Text und Bild: Carl Zeiss Microscopy GmbH |