Peptid-Profilanalyse aus Körperflüssigkeiten

Zweidimensionale Säulen-Flüssigkeitschromatographie mit integrierter Probenaufbereitung

von Dr. Klaus K. Unger

Nach den raschen Erfolgen in der Genomforschung durch den Einsatz der mehrdimensionalen Kapillarelektrophorese, der Polymer Chain Reaction (PCR)-Technologie und anderen Methoden [1], begann man um die Jahrtausendwende, das Proteom-Projekt anzugehen. Zunächst geschah dies mittels zweidimensionaler Gelektrophorese, gekoppelt mit hochempfindlichen Staining-Techniken und hochauflösender Massenspektrometrie. Die Erfolge waren beachtlich [2].

Allerdings dauerte die Analyse einer Probe mehrere Tage, und die Methode ließ sich nur begrenzt automatisieren. Es war naheliegend, nach alternativen Separationstechniken zu suchen, die eine hohe Auflösung erwarten ließen, vor allem automatisiert angewendet werden konnten und damit eine höhere Reproduzierbarkeit ermöglichten.
Die Herausforderungen, Proteine aus Körperflüssigkeiten wie Serum, Plasma, Urin etc. zu isolieren, zu identifizieren und zu quantifizieren, sind enorm: die Zahl der vorliegenden Spezies beträgt mehrere Millionen. Sie besitzen die unterschiedlichste chemische Struktur. Das Abundanz-Verhältnis beläuft sich auf 1:10E+08. Die interessanten Targetproteine umfassen einen Konzentrationsbereich von Micromol bis Femtomol und weisen geringe strukturelle Unterschiede auf.
Die Aufgabe besteht folglich einmal darin, die hochabundanten Bestandteile wie z.B. Albumin u.a. zunächst quantitativ zu entfernen und dann mit hochselektiven Trennmethoden die zu interessierenden Bestandteile aufzulösen und sie mittels hochauflösender Massenspektrometrie zu identifizieren und zu quantifizieren. Als eine der viel versprechenden, alternativen Methoden wurde die HPLC betrachtet. Die HPLC ist sowohl im analytischen als auch im präparativen Maßstab und zur Probenaufbereitung einsetzbar. Sie lässt sich automatisieren und verfügt über ein breites Spektrum an leistungsfähigen und selektiven Separationsmethoden, wie z.B. die Umkehrphasen-Chromatographie mit Gradientenelution [3,4].
Die Lösung des Problems bei der Proteomforschung bestand deshalb in der Entwicklung und Anwendung der mehrdimsionalen HPLC (MD-LC) mit integrierter Probenaufbereitung, online und voll automatisiert, vor allem im Hinblick auf den Einsatz in der Pharmaforschung. Bei der Online-MD-LC werden HPLC-Methoden mit unterschiedlicher Selektivität gekoppelt – z.B. die Ionenaustausch-Chromatographie und die Umkehrphasen-Chromatographie.Die erste Säule dient dabei als Fraktioniersäule (z.B. Ionenaustauschersäule) , bei der wenige Fraktionen aufgefangen werden. Diese werden online auf eine zweite Säule (z.B. einer Umkehrphasensäule) über ein Schaltventil injiziert, die eine hohe Auflösung besitzt und deren Fließmittel kompatibel mit einer massenspesktrometrischen Detektion ist. Die erhaltenen Fraktionen werden dann online oder offline einem hochauflösenden Massenspektrometer zugeführt, das die Bestandteile nach Masse pro Ladung identifiziert. Dann erst beginnt die eigentliche Arbeit: Die Rohdaten müssen statistisch aufgearbeitet werden und in eine Datenbank eingegeben werden, um festzustellen, ob es sich um ein bekanntes oder bisher unbekanntes Protein handelt.
Im Prinzip lassen sich mehrere HPLC-Techniken zu einem multidimensionalen System koppeln. Damit steigt auch der apparative Aufwand. Die Abbildung 1 zeigt ein dreidimensionales System, das von uns in Kooperation mit der R&D-Abteilung von AstraZeneca (Lund, Schweden) entwickelt wurde [5].









Abb. 1 Ansicht einer dreidimensionalen, vollautomatischen LC-Anlage zur Analyse von Körperflüssigkeiten mit integrierter Probenaufbereitung
Erste Dimension, Resticted-Access Kationenaustauscher-Säule, Kationenaustauscher-Säule, Reversed-Phase-Säulen, gepackt mir unporösen 2 µm C18 Kieselgelteilchen


Eine solche Anlage in einem Routinelabor zu betreiben, ist nicht empfehlenswert. Schwerpunkt unserer Arbeiten war die Profilanalyse von Peptiden aus Körperflüssigkeiten mit dem Ziel, Biomarker zu finden. Das Ergebnis war eine zweidimensionale -Vorgehensweise mit gekoppelter Probenaufbereitung (Abb. 2). Die Abbildung 3 zeigt das erhaltene Peptidprofil aus zwei unterschiedlichen Urinproben [6].

Abb.3: Peptid-Profilanalyse von Urin zweier Patientenproben (schwarze und rote Punkte)

Ergebnisse

Auf der Basis unserer Arbeiten konnten wir zeigen, dass es möglich ist, mehrere tausend endogene Peptide aus verschiedenen Körperflüssigkeiten im Molmassenbereich von 1 000 bis 5 000 mittels zweidimensionaler HPLC und hochauflösender Massenspektrometrie zu analysieren. Die Methode war reproduzierbar und robust. Eine Analyse dauerte sechs Stunden. Der Technologietransfer der erarbeiteten Methode an eine Klinik (Charité, Berlin) wurde durchgeführt.

Literatur
[1] Christoph W. Sensen Ed., Handbook of genome research. 2005 Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 618.
[2] G. Marko-Varga Ed., Proteomics and peptidomics: new technology platforms elucidating biology. Wilson & Wilson’s: Comprehensive analytical chemistry Ed. D. Barcelo, Vol 46. 2005, Elsevier, 632.
[3] E. Machtejevas, K.K. Unger, in: Jörg von Hagen (Editor), Proteomics Sample Preparation, Sample preparation for HPLC – based proteome analysis. 2008 Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 245-264.
[4] E. Machtejevas, K.K. Unger, in: Steven A. Cohen and Mark R. Schure (Editors), Multidimensional Liquid Chromatography: Theory and Applications in Industrial Chemistry and the Life Sciences, Peptidomics. 2008 John Wiley & Sons Inc., Hoboken, New Jersey, USA, 207-220.
[5] Wagner, K., Miliotis, T., Marko-Varga, G., Bischoff, R., Unger K.K., Anal. Chem. 2002, 74, 809-820.
[6] E. Machtejevas, G. Marko-Varga, C. Lindberg, D. Lubda, R. Hendriks, K.K. Unger. Profiling of Endogenous Peptides by Multidimensional Liquid Chromatography: On-line Automated Sample Cleanup Procedures for Biomarker Discovery in Human Urine. J. Sep. Sci. 2009, 32, 2223 – 2232