Pestizide präzise ­bestimmen

Online-SPE/LC-MS/MS für die Spurenanalytik von Pestiziden in Realwasserproben

von Dr. Edgar Naegele

Die Festphasen-Extraktion (Solid Phase Extraction, SPE) ist die Methode der Wahl, wenn es darum geht, Analyten im Spurenbereich anzureichern oder störende Inter­ferenzen, die die Ionisation in der Ionenquelle des Massenspektro­meters unter­drücken ­können (ion suppression), zu entfernen. Bei der SPE von Pestiziden aus Trink-, Grund und Oberflächen­wasser werden vorzugsweise hochkapazitive polymere Materialien verwendet, weil polare Analyten ­häufig zum Durchbruch neigen, ­wenn größere ­Proben­volumina auf die Kartusche gegeben werden.

Die nachfolgende Applikation zeigt die Möglichkeit auf, Herbizide im Spurenbereich bis zu 1 ng/l in Wasserproben mit einer Polymerphase automatisiert anzureichern und zu eluieren, die dann nachfolgend getrennt und detektiert werden. Die Stoffauswahl orientiert sich an der Europäischen Richtlinie 98/83/EC [1], die besagt, dass Trinkwasser u.a. auf Herbizide hin untersucht werden muss. Die Richtlinie hat eine Nachweisgrenze von 25 ng/l für alle Pestizide festgesetzt. Um diesen Grenzwert mit einem Triple Quadrupole-Massenspektrometer der Einstiegs- oder mittleren Preisklasse zu erreichen, muss gewöhnlich ein größeres Probenvolumen (> 1 ml) auf einer Probenvorbereitungssäule angereichert werden, bevor die Elution auf die analytische Säule stattfindet. Im vorliegenden Fall wird die Online-SPE mithilfe eines speziellen HPLC-Moduls durchgeführt. Das Besondere an der Gesamtkonfiguration ist, dass nur eine HPLC-Pumpe notwendig ist. Als Anreicherungsphase wird in den Kartuschen ein Polymer verwendet, das für die SPE von Wasserkontaminanten häufig verwendet wird. Eine Ventilschaltung für die parallele Nutzung von zwei Anreicherungssäulen erhöht den Probendurchsatz. Dieses leistungsfähige System ermöglicht Anreicherung, Trennung und massenspektrometrische Detektion von Herbiziden bis hin zu einer Detektionsgrenze von weniger als 10 ng/l.

Experimentelles
Instrumenteller Aufbau

Agilent 1200 Infinity Series Online SPE Solution inklusive Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS mit Agilent Jet Stream Technologie, SPE-Anreicherungssäulen: Agilent PLRP-S Kartuschen, Analytische HPLC-Säule: Agilent ZORBAX, Eclipse Plus C18, Software: Agilent MassHunter

HPLC-Methode

Setup

Das Agilent 1290 Infinity Flexible Cube ­Modul beinhaltet ein 2-Positionen/10-Port Ventil mit zwei Anreicherungssäulen, eine Kolbenpumpe und das Lösemittel-Auswahlventil zum Aufgeben der Probe auf die Anreicherungssäule und für die Re-Äquilibrierung dieser Säulen (Abb. 1). Die Kolbenpumpe im Inneren des „Flexible Cube“ bringt die Probe direkt auf die Anreicherungssäule (SPE 1), die andere SPE-Säule (SPE 2) ist mit der LC-Pumpe verbunden, die Analyten werden von dort auf die Trennsäule eluiert (Abb. 2). Nach der Probenaufgabe wird das 2-Positionen/10-Port Ventil geschaltet, die Positionen der Anreicherungssäulen werden getauscht. Die Analyten werden mit dem Gradienten, den die LC-Pumpe liefert, im Backflush von der Anreicherungssäule (SPE1) auf die analytische Säule eluiert. Gleichzeitig wird die Anreicherungssäule (SPE2), die im vorangegangenen Lauf mit Probe beladen war und bereits eluiert wurde, nun gereinigt und rekonditioniert.

Triple Quadrupole MS/MS-Methode

MRM-Methoden wurden mithilfe von direkten Fließinjektionen individueller Pestizidstandards (1 mg/L) in das Massenspektrometer über die MassHunter Optimizer-Software entwickelt. Damit wurde die optimale Fragmentierungsspannung und die optimalen Kollisionsenergien für die Fragmentierung zu Quantifier- und Qualifierionen ermittelt. Die MRM-Methode wurde auf eine Standardmischung von 100?ng/l angewandt, um die Retentionszeiten der einzelnen Verbindungen zu identifizieren. Aus den Daten wurde die dynamische MRM-Methode mit einem Retentionszeitfenster von dem ± Dreifachen der gemessen Peakweite bei der Retentionszeit jeder einzelnen Verbindung erstellt.

Kalibrierstandard

Pestizid-Stammlösung: 100ng/L in Wasser.

Proben

Oberflächenwasserproben wurden direkt aus dem Rhein entnommen. Weitere Proben stammten aus Leitungswasser und Quellwasser (Region um Karlsruhe). Die Wasserproben wurden auf eine Pestizid-Endkonzentration von 25ng/L dotiert, durchmischt, membranfiltriert (0.45m) und injiziert.

Ergebnisse und Diskussion

Verfahrenskenndaten für die online-SPE/LC-MS/MS-Messung

Für Kalibrierkurven jeder Verbindung wurde die Multiherbizid-Stammlösung über acht Konzentrationsniveaus (100, 50, 20, 10, 5, 2, 1 und 0,5ng/L) verdünnt. Die Pestizide wurden mit der online-SPE-LC-Methode angereichert, eluiert und chromatografiert und mittels dynamischem MRM-Verfahren quantitativ bestimmt. Für die Bestimmung der Nachweisgrenze NG (LOD) wurde ein Signal-Rausch-Verhältnis von 3, für die ­Bestimmungsgrenze BG (LOQ) ein S/N-Verhältnis von 10 gewählt. Der Kalibrier­bereich erstreckte sich von der Bestimmungsgrenze bis 100ng/l. Die Abbildung 3 zeigt den Massenübergang zum Quantifierion von Isoproturon im Konzentrationsbereich von 1 bis 10ng/l bei einer Retentionszeit von 15,48 min. Die Kalibrierung über den gesamten Kalibrierbereich (1ng/l bis 100ng/l) ergab einen Linearkoeffizienten von 0,9986. In Tabelle 1 sind die vollständigen ­Daten für alle Herbizide wiedergegeben. Typischerweise bewegen sich die Bestimmungsgrenzen zwischen 1 und 5ng/l und die entsprechenden Detektionsgrenzen zwischen 2 und 0,5 ng/l. Die Linearkoef­fizienten lagen typischerweise bei Werten über 0,997. Die relative Standardabweichung der Retentionszeiten war ausgezeichnet mit Werten typischerweise unter 0,1%. Die relative Standardabweichung der Peakflächen bewegte sich typischerweise zwischen 5 und 7,6%. Die Wiederfindung der einzelnen Pestizide bei der online-SPE wurden berechnet durch Vergleich der Peakflächen einer Injektion nach SPE zu einer direkten Injektion gleicher Konzentration und Volumens auf die analytische Säule. Die Wiederfindungsraten von 20 Verbindungen waren größer 90%; die anderen Verbindungen wiesen Wiederfindungsraten zwischen 80 und 90% auf. In den Anreicherungskartuschen wird PLRP-s als stationäre Phase eingesetzt. Es handelt sich dabei um ein organisches Polymer mit geeigneter Porenweite und spezifischer Oberfläche für die Anreicherung von unterschiedlich polaren Kontaminanten aus Wasser (z.B. Pestizide, Arzneistoffe). Insgesamt ist die online-SPE eine effektive Alternative zur manuellen Offline-Festphasenextraktion, weil die einzelnen Verfahrensschritte automatisiert ablaufen. Vor allem können deutlich geringere Probenvolumina für geringere Bestimmungsgrenzen aufgegeben werden, weil die gesamte Menge am extrahierten Analyt erfasst wird. Die Online-SPE führt zu einer enormen Zeitersparnis bei verbesserter Präzision und Richtigkeit. Da die Kartuschen mehrfach verwendet werden, muss die mögliche Analytverschleppung bekannt sein. Diese wurde für drei der signalstärksten Verbindungen, Isoproturon, Terbutryn und Metoxuron, bestimmt. Die Verschleppung von einer 100 ng/l-Injektion zu einer nachfolgenden Leerinjektion betrug 0,11%. Dies war ungefähr 10% der Bestimmungsgrenze. Bei Terbutryn betrug die Analytverschleppung einer 100ng/l-Injektion auf eine nachfolgende Leerinjektion 0,28%, was ungefähr 26% der Bestimmungsgrenze entspricht. Der Carry-over einer 100ng/l-Injektion von Metoxuron zu einer nachfolgenden Leerinjektion lag unter der Nachweisgrenze.

Realproben

Um die Leistungsfähigkeit des online-SPE/LC-Systems an Realproben zu überprüfen, wurden dotierte Wasserproben (28 Pestizide, c= 25ng/l) aus dem Rhein, Trinkwasser und Wasser einer Quelle aufgearbeitet. Die Analysen lieferten vergleichbare Ergebnisse für eine große Anzahl der zudotierten Herbizide – unabhängig von der Herkunft der Wasserprobe (Abb. 4). Dies bedeutet im Umkehrschluss, dass Matrixeffekte durch in den Proben gelöste Salze oder andere Kontaminanten mit hoher Ionenstärke, welche die Ionisation der Analyten beeinträchtigen können, keine Rolle spielen. Die relative Standardabweichung der Konzentrationen lag zwischen 2,3% und 2,8%. Die Wiederfindung von Sollwert zu ermittelter Massenkonzentration war stets über 90%. Gewässertypische Wiederfindungsraten wurden für die Mehrzahl der Herbizide nicht beobachtet.

Fazit

Im Rahmen der beschriebenen Applikation konnte gezeigt werden, dass die niedrigste Detektionsgrenze bei einer Konzentration von 0,5ng/l und die Bestimmungsgrenze bei 1ng/l lagen. Die Gesamtmethode weist hohe Messpräzision mit Flächenabweichungen von weniger als 7% auf. Mithilfe dieser online-SPE-Methode ist es möglich, Pestizide routinemäßig in Trinkwasser­proben mit hoher Präzision und Genauigkeit unterhalb der Grenzwerte der EU-Richtlinie zu bestimmen.

Literatur beim Autor

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