UHPLC - Nachweis UV-absorbierender Substanzen in Sonnenschutzmitteln

UHPLC - Photodiodenarray-Detektor

Dave Thomas, Applikationsmanager, Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA USA
Anton Mayer, Chromatographie Marketingmanager, Thermo Fisher Scientific GmbH, Dreieich

Sonnenschutzcremes sollen die Haut vor schädlicher UV-Strahlung im mittleren (UV-B) und nahen Wellenlängenbereich (UV-A) schützen. Dies wird durch UV-absorbierende Bestandteile in einer Ölemulsion erreicht. Einige UV-absorbierende Substanzen können jedoch auch die Hormonsysteme von Menschen und Wasserlebewesen schädigen. Deswegen ist eine effektive Methode zum schnellen und zuverlässigen Messen UV-absorbierender Substanzen in handelsüblichen Sonnenschutzmitteln erforderlich. Ultrahochleistungs-Flüssigchromatographie (U HPLC) mit einem Photodiodenarray-Detektor (PDA) eignet sich optimal dafür und überwacht UV-absorbierende Substanzen in Sonnenschutzmitteln und in Umweltuntersuchungen genau und schnell.

Einleitung

Gegenwärtig existieren viele Verfahren zum Nachweis UV-absorbierender Bestandteile in Konsumgütern und für die Charakterisierung der UV-Absorptionsspektren der einzelnen Substanzen. Bisher wurden für solche Analysen Verfahren wie Dünnschichtchromatographie (DC, engl. TLC), Gaschromatographie (GC) und Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) angewandt. Von diesen drei Verfahren sind Gaschromatographie und Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie am universellsten, genauesten, zuverlässigsten und zweckmäßigsten. Gas- und Dünnschichtchromatographie können jedoch Matrizes, bei denen sich die Extraktion schwierig gestaltet oder die nichtflüchtige Sonnenschutzbestandteile enthalten, nicht mit ausreichender Zuverlässigkeit analysieren. Darüber hinaus eignet sich die Dünnschichtchromatographie nur bedingt für automatisierte Labors [1]. Einige Bestandteile von Sonnenschutzmitteln sind aufgrund nichtflüchtiger Substanzen, die sich einer routinemäßigen Analyse entziehen, besonders schwierig mit Gaschromatographie nachzuweisen, wie z.B. 4 Diethanolamin p-Methoxycinnamat, und analysiert diese Sonnenschutzsalze mit Hilfe der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC). [2] In jüngster Zeit hat sich die Ultrahochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (U-HPLC) als ideale Methode zum Nachweis UV-absorbierender Substanzen in Sonnenschutzcremes erwiesen. Wegen der emulsionsartigen Struktur von Sonnenschutzmitteln und der hohen UV Absorptionsrate der Analyte hat sich die U-HPLC als das geeignetste Verfahren für solche Analysen etabliert. Bei Verwendung von U-HPLC mit Photodiodenarraydetektoren (PDA) kann beim Eluieren das vollständige Absorptionsspektrum jedes Bestandteils erfasst werden. Die Empfindlichkeit des U-HPLC/PDA-Verfahrens reicht auch zum Nachweis dieser chemischen Verbindungen in Wasserproben für Umweltanalysen aus, was Forschungen zu Expositionen und Umweltschäden erleichtert.

Sonnenschutzmittel

Fast die Hälfte der in den USA auftretenden Krebsfälle rührt vom Hautkrebs her. 2007 wurden mehr als eine Million neuer Fälle diagnostiziert, und über 10.000 Menschen starben an Hautkrebs. In der Mehrzahl dieser Fälle wurden Erkrankungen durch Haut schädigende Sonneneinstrahlung verursacht. Die schädigendste Strahlung tritt in zwei als UV-B und UV-A bezeichneten Wellenlängenbereichen auf, und die Art der Schädigung ist je nach Bereich unterschiedlich. UV B Strahlung liegt im Wellenlängenbereich von 290–320 nm und wird hauptsächlich an der Hautoberfläche absorbiert, was Hautrötungen und Sonnenbrand hervorruft. Strahlung im Bereich von 320–400 nm (UV-A) tritt tiefer in die Haut ein und erreicht die inneren Hautschichten. Sie ist für viele der Hautschäden wie Elastizitätsverlust und Faltenbildung verantwortlich, und verursacht frühzeitige Alterungserscheinungen. Sowohl UV-B- als auch UV-A-Strahlung sind krebserregend, und UV-A-Strahlen können darüber hinaus DNA-Schäden an Zellen der unteren Hautschichten verursachen, was die Wahrscheinlichkeit der Bildung bösartiger Melanome erhöhen kann [3]. Sonnenschutzcremes sollen die Haut vor schädlicher UV-B- und UV-A-Strahlung schützen. In ihnen werden UV-absorbierende chemische Verbindungen in einer Emulsion verteilt, die auch Weichmacher, Hautfeuchtigkeitskomponenten und Licht reflektierende Zinkoxidpartikel enthalten kann. Zu den gebräuchlichen UV-absorbierenden Substanzen, die Sonnenschutzmitteln zugesetzt werden, gehören Oxybenzon (Benzophenon), Avobenzon, Octinoxat (Octyl-Methoxycinnamat), Octisalat ( Octylsalicylat), Homosalat und Octocrylen. Die gleichen UV-absorbierenden Substanzen, die die Haut vor schädlicher Sonneneinstrahlung schützen, können jedoch auch Hormonsysteme schädigen und Missbildungen an Fischen, Fröschen und anderen Wasserlebewesen hervorrufen. In der Schweiz im Jahre 2006 durchgeführte Forschungen haben gezeigt, dass die gebräuchlichen Sonnenschutzmittelzusätze 4-Methylbenzyliden- Camphor (4-MBC) und Octocrylen im Wasser auftreten und sich in Fischen ansammeln [4]. In einer weiteren Studie mit sechs in Sonnenschutzmitteln verwendeten Chemikalien fand man heraus, dass Octyl-Methoxycinnamat (OMC) und Homosalat (HMS) erhebliche östrogene Aktivitäten verursachen, wie anhand des gesteigerten Auftretens in-vitro gezüchteter menschlicher Brustkrebszellen (MCF-7) nachgewiesen wurde [5]. Eine Sonnenschutzmitteluntersuchung der US-Umweltorganisation Environmental Working Group aus dem Jahr 2009 zeigt, dass die UV-absorbierende Substanz Oxybenzon das menschliche Hormonsystem schädigt und reaktive Sauerstoffspezies freisetzt, die die Bildung von Hautkrebs fördern können [6]. Dieser Artikel beschreibt, wie ein in einem Unternehmensanalyselabor eingesetztes U-HPLC-Verfahren durch Verwendung mit PDA zum Nachweis UV-absorbierender Substanzen in handelsüblichen Sonnenschutzcremes und in Schwimmbadwasser verbessert wurde. Darüber hinaus werden Chromatographieparameter wie Auflösung, Kalibrierbereich, durch das Verfahren erzielte Nachweisgenzen und die Retentionszeitgenauigkeit sowie Peak-Flächen dokumentiert. *Versuchsanordnung*

Für die Analyse wurde das Hochgeschwindigkeits-Chromatographiesystem Thermo Scientific Accela verwendet. Es wurde eine proportionierte mobile Phase benutzt. Reservoirflasche A der Accela Pumpe wurde mit Lösungsmittel Wasser in HPLC-Qualität gefüllt und die Lösungsmittelkapillare dann mit mindestens 30 mL Wasser gespült. Danach wurde an Reservoir B eine neue Flasche mit Acetonitril in HPLC-Qualität angeschlossen und auf die gleiche Weise gespült. Für die Analyse wurde ein Standard von 200 mg/L verwendet. Insgesamt 10 mg jeder reinen chemischen Verbindung/Substanz wurden präzise in einen 50 mL Messkolben abgemessen und 25 mL Acetonitril hinzugefügt. Die Lösung wurde mit Hilfe eines Vortexes gemischt, fünf Minuten in ein Ultraschalbad gestellt, anschließend mit Acetonitril auf das erforderliche Volumen aufgefüllt und abschließend noch mal gemischt. Die Intermediär- Standardlösung wurde mithilfe einer kalibrierten Pipette mit der mobilen Phase in Messkolben auf 100, 50, 20, 5, 1, 0,2, 0,05 und 0,03 mg/L verdünnt. Als Verdünnungsmittel wurde hier die mobile Phase verwendet.

Probenvorbereitung

Es wurden Proben aus drei handelsüblichen, im lokalen Einzelhandel erworbenen Sonnenschutzcremes entnommen: Coppertone Water Babies SPF 50 Sunscreen Lotion, Coppertone Sunscreen LotionSPF 45 (Schering-Plough HealthCare Products) und Banana Boat Kids Sunblock Lotion SPF 30 (Sun Pharmaceuticals Corp.). Die Probenvorbereitung für die U HPLC-Analyse begann mit dem Transfer von 0,2 g Creme in einen 100 L-Messkolben. Dazu wurde ca. 5 mL Wasser in HPLC-Qualität zuzugegeben. Der Kolben wurde dann verschlossen und intensiv geschüttelt, damit sich die Bestandteile gut mischen. Der Kolben wurde mit circa 50 mL Acetonitril versetzt und in einem Ultraschallbad 10 Minuten lang behandelt, um alle Bestandteile aufzulösen und gleichmäßig zu verteilen. Die Lösung wurde mit Acetonitril auf das erforderliche Volumen aufgefüllt, gemischt und vor der Analyse durch ein 0,45 ?m-Spritzenvorsatzfilter aus Nylon in einen Autosampler Vial aus Glas gefiltert. Aus einem kommunalen Schwimmbad wurde eine Wasserprobe entnommen und mit Festphasenextraktion (engl. solid phase extraktion, SPE) aufbereitet. Eine HyperSep SPE-Kartusche (Bettgewicht 100 mg, Bettvolumen 1 mL) wurde mittels eines Vakuum Manifolds durch Spülen mit 2 mL Methanol gefolgt von 2 mL Wasser in LC/MSQualität konditioniert. Während der Aufbereitung wurde das Vakuum so eingestellt, dass durch die SPE-Kartusche eine Durchflussgeschwindigkeit von ca. 1–2 mL pro Minute erfolgte. 20 mL der Probe flossen mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 1–2 ml/min durch die Kartusche. Die Analyte wurden mit 5 mL Acetonitril in ein 5-ml-Reagenzglas eluiert. Das Extrakt wurde in einem Verdampfer vom Typ Caliper LifeSciences TurboVap®LV bei 35 °C unter Stickstoffstrom bei 17 PSI abgedampft. Die Probe wurde dann in 200 ?l mobiler Phasenlösung aufgenommen, in einen Autosampler Vial gefiltert und injiziert.

Systemvorbereitung

Es wurde eine Thermo Scientific HypersilGOLD Säule (1,9 ?m, 2,1 x 100 mm) installiert und sichergestellt, dass die Anschlüsse korrekt waren. Es wurde nochmals überprüft, dass das U-HPLC System mit den korrekten ultrahochdruckstabilen Schläuchen (1/16“ Tubings, Innendurchmesser 0,127 mm) und Verbindungsstücken ausgestattet ist. Bei allen Kapillaranschlüssen wurde sichergestellt, dass die Kapillarenden gerade geschnitten und gratfrei waren. Zur Detektion wurde eine 1cm Durchflusszelle vom Typ Thermo Scientific LightPipe verwendet. Nach erfolgter Equlibrierung des U-HPLC Systems war das System zur Messung von Standard- und Probenlösungen bereit. Überwachen der Druckpulsation und Testen der Genauigkeit der Pumpenproportionierung spielte eine wichtige Rolle.

Ergebnisse und Auswertung

Die U-HPLC-Trennung von Sonnenschutzmittelkomponenten bot im Vergleich zu herkömmlichen in Unternehmenslabors eingesetzten Verfahren (Abbildung 1B) eine bessere Auflösung, schärfere Peakformen sowie kürzere Laufzeiten (Abbildung 1A). Besonders bemerkenswert war die sechsfache Verbesserung bei Laufzeit und Probendurchsatz. In Tabelle 1 sind die Ergebnisse für die Verfahrensparameter (Peak-Auflösung, linearer Kalibrierbereich, dynamischer Bereich, Nachweisgrenzen und Genauigkeit der Retentionszeit sowie Peak-Bereich) zusammenfassend aufgeführt. Bei den meisten Analyten war die Genauigkeit des Peak-Bereichs besser als 1 % RSD (relative Standardabweichung); bei Vollschleifeninjektionen besser als 0,15 % RSD. Zum Erzielen einer optimalen Genauigkeit und eines guten Toleranzbereichs empfehlen wir eine Vollschleifeninjektion aus einer kalibrierten Probenschleife. Mit einer 1 ?l-Teilschleifeninjektion erhaltene minimale Nachweisgrenzen lagen in der Größenordnung von 0,1–0,8 mg/L, was für die Analyse handelsüblicher Produkte mehr als ausreichend ist. Zur Umweltanalyse von Wasserproben lieferte das SPE-Verfahren eine 100-fache Probenkonzentration. Bei Bedarf kann zur weiteren Absenkung der Nachweisgrenzen auch ein höheres Injektionsvolumen verwendet werden. Abbildung 2 zeigt ein Chromatogramm von Sonnenschutzmittel 2, und in Tabelle 2 ist die für jede Probe ermittelte Konzentration UV-absorbierender Substanzen aufgeführt. Die Messergebnisse stimmten gut mit den auf dem Produktetikett angegebenen Nennwerten überein; kein Wert wich mehr als 10 % ab. Bei der Schwimmbadwasserprobe lagen die Nachweisgrenzen nach der Festphasenextraktion im Vergleich zur Direktinjektion 50-fach niedriger. In der Wasserprobe wurde lediglich Oxybenzon mit einer Konzentration von 10 ?g/l nachgewiesen. Die vom PDA-Detektor erfassten UV-Absorptionsspektren boten drei wichtige Vorteile: 1. Das Spektrum jeder chemischen Verbindung konnte in einer Spektren-Bibliothek abgespeichert und später gegen Proben unbekannter Zusammensetzung verglichen werden, um Analyte in Proben nachzuweisen und zu bestätigen. 2. Der Peak-Reinheitsindex erkannte automatisch schlecht aufgelöste Peaks wie z.B. die von Zerfallsprodukten. 3. Da die Zusammensetzung von Sonnenschutzmitteln speziell auf den Schutz vor bestimmten Wellenlängenbereichen des Sonnenlichts abgestimmt ist, wurde das Spektrum jeder Substanz eindeutig als UV-B-, UV-A- oder breitbandabsorbierend identifiziert. Abbildung 3 zeigt die von Thermo Scientific ChromQuest angezeigten Spektraldaten für das Sonnenschutzmittel 2. Aus der Darstellung des Isoabsorption bzw. der dreidimensionalen Darstellung war einfach zu ermitteln, welche Bestandteile gegen UV-A-(Absorption unter 320 nm), UV-B-Strahlung (über 320 nm) und gegen ein Breitbandspektrum an Wellenlängen schützen. U HPLC mit PDA ist ein leistungsfähiges Verfahren zum Nachweis sechs UV-absorbierender Bestandteile von Sonnenschutzmitteln im Verlauf von sieben Minuten mit Retentionszeiten und Peakbereichsgenauigkeiten unter 1 % RSD. Das UV-Absorptionsspektrum jeder chemischen Verbindung wird bei der Eluierung erfasst und kann zur schnelleren Substanzidentifizierung gegen abgespeicherte Spektralbibliotheken verglichen werden. Die Auflösung benachbarter Peaks wird trotz der Verkürzung der Methodenlaufzeit von 45 auf 7 min verbessert; mit einer 1 ?l-Teilschleifeninjektion ermittelte minimale Nachweisgrenzen lagen in der Größenordnung von 0,1–0,8 mg/l. Fazit In Sonnenschutzmitteln enthaltene UV-absorbierende Substanzen schützen die Haut zwar vor Schädigungen durch Sonneneinstrahlung, können jedoch das Hormonsystem von Menschen und Wasserlebewesen negativ beeinflussen. Herkömmliche Chromatographieverfahren wie Dünnschicht-, Gas- und Hochleistungs-Flüssigchromatographie können komplexe Matrizen von Sonnenschutzmitteln nicht effektiv analysieren. U HPLC ist dafür eine effektive Alternative. In Verbindung mit Photodiodenarraydetektor PDA stellt dies ein leistungsfähiges, nur wenige Minuten dauerndes Verfahren zum Nachweis UV-absorbierender Bestandteile in Sonnenschutzmitteln dar. Hohe Retentionszeiten, eine erhöhte Peakbereichsgenauigkeit und verbesserte Auflösung werden auf einfache Weise erreicht. Die Empfindlichkeit des U-HPLC/PDA-Verfahrens reicht darüber hinaus auch zum Nachweis UV-absorbierender Substanzen in Wasserproben für die Umweltanalyse aus.

Referenz
[1] Shaath, Nadim A. Analysis of sunscreen chemicals: separation and identification techniques. Cosmetics and Toiletries, 1989.
[2] Nicholas J. Lowe, Nadim A. Shaath, Madhu A. Pathak. Sunscreens: Development, Evaluation, and Regulatory Aspects, Cosmetic Science and Technology Series; V. 15 veröffentlicht von: New York Marcel Dekker, Inc., 1997.
[3] Armstrong, B.K., and A. Kricker. How much melanoma is caused by sun exposure? Melanoma Research, 1993: 3:395-401.
[4] Hans-Rudolf Buser, Marianne E. Balmer, Peter Schmid, and Martin Kohler. Environ. Sci. Technol., 2006, 40, (5), pp 1427-1431.
[5] Schlumpf M, Cotton B, Conscience M, Haller V, Steinmann B, Lichtensteiger, W (2001). In vitro and in vivo estrogenicity of UV screens. Environmental Health Perspectives 109(3): 239-244.
[6] Environmental Working Group website. 2009 Sunscreen Investigation. Section 1: Summary of Findings. http://www.ewg.org/cosmetics/report/sunscreen09/investigation/ summary-of-findings

>> www.thermo.com