UHPLC - Optimierung der Auflösung

Eine Marktübersicht der Säulenmaterialien

von Dr. Andrea Junker-Buchheit, Dr. Jürgen Maier-Rosenkranz

Ultra (high) performance chromatography uHPLC – seit der Einführung des ersten LC-Systems 2004 durch Waters gibt es kaum einen Geräte- oder Säulenhersteller, der auf diesem Gebiet nicht aktiv ist. Diese Übersicht soll aufzeigen, welche Säulenmaterialien gegenwärtig auf dem Markt verfügbar sind und welche Möglichkeiten es gibt, die Selektivität als wichtigsten Parameter zur Optimierung der Auflösung zu nutzen.

Was macht die uHPLC eigentlich so interessant?

Das Ziel, die Analysenzeit zu reduzieren, erhöht die Wirtschaftlichkeit eines jeden Labors, das eine hohe Zahl von Proben tagtäglich zu bewältigen hat. Ob in der Pharmakokinetik, in der forensischen Toxikologie, in Umwelt- oder Lebensmittellabors – dort, wo zahlreiche
Proben anfallen, müssen Ergebnisse schnell, reproduzierbar und vor allem richtig generiert werden. Um schnellere Analytik zu betreiben, wurden bei konventioneller HPLC von Säulen mit 5 µm auf Säulen mit 3 µm Partikelgrößen gewechselt – wobei die übliche Säulenlänge von 250 mm auf die Hälfte und weniger reduziert wurde. Auch hat die Einführung mono-
lithischer Säulen sowie Säulen mit nicht-porösen 1.5 µm Partikeln und poröser Silikaschicht (z.B. HaloTM HPLC-Säulen) dazu geführt, Analysenzeit zu verkürzen.
Allerdings baut sich bei Verwendung von sub 2 µm Partikeln ein entsprechend hoher Rückdruck auf, der von einem leistungsfähigem LC-System bewältigt werden
muss. Daher müssen die kieselgelbasierten Partikel eine hohe mechanische Belastbarkeit aufweisen und diesen Drücken (bis 1000 bar) widerstehen. Zudem erwartet der uHPLC-Anwender auch eine hinreichend gute pH-Stabilität und Standzeit der Säule – alles in allem eine robuste Säule, die sich in das chromatographische Trennsystem aus hohen Drücken
und Flüssen einfügt.
Die uHPLC bietet dem Anwender nun zwei Möglichkeiten, diesen erweiterten Druckbereich auszunutzen. Kurze Säulen (30 bis 50 mm), gepackt mit sub 2 µm Partikeln, welche bei normaler Anwendung bereits Drücke von 250–350 bar haben, können nun auch bei höheren Flussraten eingesetzt werden, um Analysenzeit zu verringern. Die zweite Möglichkeit ist
die Länge dieser Säulen zu erhöhen, um maximale Bodenzahl und Peakkapazität (= Zahl der pro Zeiteinheit aufgelösten Peaks) zu erhalten. Dadurch eignet sich die uHPLC besonders zur Trennung und Bestimmung von komplexen Substanzgemischen. Zudem
wird die Empfindlichkeit durch das Vorliegen von „scharfen“ Peaks infolge eines ver- besserten Signal/Rausch-Verhältnisses erhöht.
In Tabelle 1 ist eine Übersicht über kommerziell verfügbare uHPLC-Phasen gegeben.

Tabelle 1: Übersicht über kommerziell verfügbare uHPLC-Phasen

Neben schnellen Trennungen interessiert vor allem die Auftrennung benachbarter Peaks – d.h. die Auflösung im ausgewählten chromatographischen System.
Aus der Gleichung 1 lässt sich ableiten, dass die Auflösung R durch Bodenzahl N, Selektivität α und Retentionsfaktor k beeinflusst wird. Die Selektivität ist groß, wenn
die zu trennenden Substanzen verschieden starke Wechselwirkungen mit dem chromatographischen System eingehen. Und es gilt, dass kleine Veränderungen von α
einen großen Einfluss auf die Auflösung haben. Dies heißt in der Praxis, eine andere stationäre oder mobile Phase auszuwählen.
Diese Beziehung gilt auch für die uHPLC und bedeutet, dass insbesondere der Selektivitätsoptimierung eine zentrale Bedeutung bei der Verbesserung der Auflösung zukommt.

Gleichung 1

Welche Strategie bietet sich nun an, um eine Trennung zu verbessern, d.h. um die uflösung auf einen Wert von > 1.5 (Basislinientrennung) zu steigern?

Der Retentionsfaktor sollte zwischen 1 und 10 liegen und ist abhängig von der eluotropen Stärke der mobilen Phase. Die Erhöhung des k-Wertes wird bei der Reversed Phase Chromatographie durch Erhöhung des Wasseranteils bei isokratischen Trennungen bzw. durch Reduzierung der Gradientensteigung bei Gradientenelution erreicht und ist identisch mit einem Anstieg der Retentionszeit und Verlust an Empfindlichkeit. Genau dies ist
aber unerwünscht. Allerdings kann dieser negative Effekt der längeren Retentionszeiten vor allem bei isokratischen Trennungen durch eine Erhöhung der Flussrate ausgeglichen
werden. Der Vorteil dieses Parameters liegt – insbesondere bei isokratischen Trennungen – in der einfachen und vorhersehbaren Umsetzung.

Für die Erhöhung der Bodenzahl N gibt es zwei Möglichkeiten: das Verkleinern der Partikelgröße oder das Verlängern der Säule. Letzteres wirkt sich wiederum negativ auf Retentionszeiten und Empfindlichkeit aus:
Die Analysenzeit steigt an, und die Empfindlichkeit wird verringert. Das Verkleinern der Partikelgröße wirkt sich hingegen nicht auf die Retentionszeiten aus, jedoch positiv
auf die Empfindlichkeit. Peaks bei gleicher Retentionszeit mit höherer Bodenzahl haben eine größere Peakhöhe und sind somit besser aufgelöst und empfindlicher messbar.
Die van Deemter-Kurve beschreibt die Abhängigkeit der Bodenzahl von der Flussrate. Während bei größeren Partikeln (5–10 µm) die Bodenzahl deutlich mit höherer Flussrate abfällt, verläuft die Kurve bei Partikeln < 2 µm weitgehend flach. So nimmt einerseits die Effizienz und damit die Auflösung bei Säulen < 2 µm zu und andererseits kann die Säule mit hohen linearen Flüssen (d.h. hoher Flussrate) betrieben werden. Das bedeutet eine Verkürzung der Analysenzeit, ohne dass Trennleistung verloren geht. So kann beispielsweise eine 2 mm i.d. uHPLCSäule mit 1 mL/min im Vergleich zu 300 µL/min bei einer Standard-3 µm Säule gleichen Innendurchmessers auf einem Standard LC-System betrieben werden. Nachteilig wirken sich jedoch zwei Effekte aus. Die Bodenzahl geht
nicht direkt in die Auflösung R ein sondern nur als &radic N. Wird die Partikelgröße von 3 µm auf 2 µm reduziert, so erhöht sich die Auflösung R nur um 22 %. Der Druck jedoch steigt im Verhältnis der Partikelgrößen im Quadrat an:
+125 %. Auch hier gilt, dass diese Umsetzung einfach und vorhersehbar ist, wenn das chromatographische System aus stationärer und mobiler Phase das gleiche bleibt.
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Bei der Betrachtung dieser Auswirkung stellt sich natürlich die Frage, warum die uHPLC oder sub 2 m Partikel doch so großes Interesse bei Anwendern finden. Historisch betrachtet gibt es bereits seit 1993 kommerziell verfügbare Säulen mit 1.5 µm Materialien (GROM). Die Nachfrage war jedoch gering; nicht zuletzt deshalb, weil zur damaligen Zeit die meisten HPLC-Systeme nicht in der Lage waren, diese schnellen Säulen zu handhaben“. Besonders im „Microbore“-Bereich, in dem das Peakvolumen noch kleiner wird, waren schon Säulen mit kleiner gleich 100 mm Länge und 3 µm nicht ausreichend gut einsetzbar.
Nach der Einführung der uHPLC sind nun die meisten kommerziellen HPLC-Systeme dahingehend optimiert, mit diesen kleinen Peakvolumina zurecht zu kommen:
die Tot- und Delayvolumina wurden drastisch reduziert, die Responsetime vom Detektor reduziert, die Messzellen optimiert (kleineres Volumen bei möglichst großer Schichtdicke) und die Datenaufnahmefrequenz erhöht. Der dritte Parameter, die Selektivität , wird über die Auswahl der stationären und mobilen Phase beeinflusst. Es ist der effektivste Parameter, weil er unmittelbar die Auflösung beeinflusst. Allerdings ist dies auch der Parameter, der am schwierigsten zielorientiert zu variieren ist und setzt mit Abstand das höchste chromatographische Know-How voraus. Für die uHPLC ist die Optimierung
der Selektivität von zentraler Bedeutung, weil die Bodenzahl N bereits maximiert ist. Moderne Methodenentwicklung gestaltet sich derart, dass auf 3 bis 5 ausgewählten
stationären Phasen bei mindestens 2 unterschiedlichen pH-Werten Screeningläufe durchgeführt werden und danach ein Fine-Tuning mit Gradient, Pufferart und -Konzentration,
organischem Modifier und Temperatur erfolgt. In diesem Zusammenhang ist es sehr begrüßenswert, dass Säulenhersteller Methodenentwicklungskits auf dem Markt gebracht haben, welche es dem Anwender erleichtern, entsprechende Säulen individuell für seine Aufgabenstellung zusammenzustellen. Als Beispiel sei hier auf den Methodenentwicklungskit der Firma Grace verwiesen (Tab. 2):

Tabelle 2: VisionHT™ Ultra High Pressure Säulen – Selektivitätskit für die uHPLC

Phasen Dimensionen
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UltraMD Kit 1 C18, C18-P, C18-HL, C18-B 100 x 2 mm
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UltraMD Kit 2 C18, C18-P, C18-HL, C18-B 50 x 2 mm
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UltraMD Kit 3 C18, C18-P, C18-HL, C18-B 50 x 2 mm
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Fazit

Mit der Entwicklung und Einführung von uHPLC-geeigneten Systemen und Säulen hat die HPLC einen unmittelbaren Innovationsschub erhalten. Der erweiterte Druckbereich auf bis zu 1000 bar ist bei vielen Anwendern willkommen – nicht zuletzt, um die Grenzen der HPLC
weiter hinauszuschieben. Dennoch sollte man sehr wohl wissen, wann sich der Einsatz schneller Trennungen lohnt und vor allem sollte – auch wie bei konventioneller HPLC – das Wissen vorhanden sein, Trennungen zu optimieren, wobei die Optimierung der Selektivität einen herausragenden Stellenwert einnimmt.

Fotos: © Dr. Andrea Junker-Buchheit