Verbesserung der Reproduzierbarkeit von Retentionszeiten

Einwandfreie HPLC-Chromatogramme

von Dr. Andrea Junker-Buchheit

Jedem Labormitarbeiter ist das hohe Gefährdungspotenzial durch Lösemittel bekannt. Dies gilt auch insbesondere für das analytische und präparative HPLC-Labor, wo eine besondere Aufmerksamkeit dem Gebrauch von Lösemitteln in Bezug auf dichte Aufbewahrung in Vorrats- und Abfallbehältnissen geschenkt werden sollte.

Insbesondere, wenn die HPLC-Anlage außerhalb von Abzügen steht, können freiwerdende Lösemitteldämpfe eine Quelle permanenter Raumluftbelastung darstellen und die Gesundheit der Mitarbeiter gefährden. Grundsätzlich ist die Gefährdungsbeurteilung für Tätigkeiten mit Gefahrstoffen im § 7 der GefStoffV (Gefahrstoff verordnung) in Verbindung mit § 5 ArbSchG (Arbeitsschutzgesetz) geregelt. Neben der potenziellen Gesundheitsgefährdung durch die Raumluftbelastung sollte letztendlich auch die Plausibilität von analytischen Resultaten hinterfragt werden. Im nachfolgenden Beitrag werden zwei Aspekte angesprochen, die häufig den realen VorOrtBedingungen in einem HPLC-Labor entsprechen: Abdampfverluste und Änderungen im Mischungsverhältnis bereits vorgemischter Eluenten, die nicht ordnungsgemäß in dicht verschlossenen Vorratsflaschen, sondern offen aufbewahrt werden und ihre Aus wirkungen auf analytische Trennergebnisse wie die Retentionszeit. Ebenso wird auch die Entsorgung von Lösemitteln angesprochen, denn beim Sammeln entzündlicher Flüssigkeiten in das Abfallsammelgefäß können statische Ladungen entstehen, die Ursache von Funkenbildung und erhöhter Brandgefahr sind.

Einflüsse auf die Chromatografie

Die Veränderung der Selektivität von Säule oder mobiler Phase, also des chromatografischen Systems, ist eine der häufigsten Ursachen für eine zumeist langsame, aber kontinuierliche Veränderung von Retentionszeiten in der HPLC. Manchmal ist eine nicht adäquate Vorbereitung komplexer Proben die Ursache, wie z. B. bei Lipiden, Polymeren, Zuckern, Cellulose. Matrixstoffe daraus können an der RP-Oberfläche der Säule adsorbiert werden und somit die „Chemie“ verändern. Dadurch ändern sich die Eigenschaften mit dem Ergebnis, dass sich auch die Retentionszeiten verschieben. Das gleiche Phänomen kann auch dann beobachtet werden, wenn sich die Zusammensetzung des Eluenten durch unbeachtete Fehler beim Ansetzen der mobilen Phase ändert. Dazu zählen beispielsweise die Art des Abmessens der einzelnen Lösemittelmengen, die Mischungsreihenfolge sowie die jeweilige Mischungstechnik. Ebenso können Entmischungsphänomene sowie Pumpendefekte während der Trennung zu veränderten Eluentenzusammensetzungen führen, die wiederum eine Verschiebung der Retentionszeiten bewirken können [1]. Nachfolgend wurde ein Test zur Reproduzierbarkeit von Retentionszeiten in der HPLC durchgeführt, der Aufklärung darüber bringen sollte, ob Abdampfverluste bei Verwendung von „offenen“ Verschlusskappen für Eluentengefäße auftreten. Die dadurch bedingten Änderungen in der Eluentenzusammensetzung können bei isokratischer Arbeitsweise über einen längeren Zeitraum zu nicht reproduzierbaren Retentionszeiten führen. Im Vergleich dazu wurden Lösemittelvorratsflaschen mit Sicherheitsverschlüssen (SafetyCaps, S.C.A.T. Europe) verwendet. Für einen praxisnahen, 20tägigen Vergleich der Chromatografie wurde eine Testmischung aus 3 polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen und eine mobile Phase aus Wasser und Acetonitril in isokratischer Betriebsweise verwendet. Als stationäre Phase wurde eine endgecappte RPPhase kleinen Säulendurchmessers eingesetzt, sodass bei niedriger Flussrate (0,5 mL) auch der Lösemittelbedarf reduziert wurde [2]. Die folgenden Testbedingungen wurden gewählt und das Experiment wie nachfolgend beschrieben durchgeführt:

Flasche A:

Diese Flasche wurde mit einem SafetyCap verschlossen, der genau auf das Standardgewinde von GL45-Glasflaschen passte. Es waren keine zusätzlichen Adapter notwendig.

Flasche B:

Diese Flasche wurde mit einer Kappe verschlossen, die eine Öffnung von 10 mm Durchmesser im Kunststoffmaterial aufwies und ein „nach außen hin offener“ Bereich von ca. 0,785 cm² entstand.

Beide Flaschen wurden zu Beginn des Tests mit einer identischen Lösemittelmischung aus Wasser und Acetonitril (20:80 w/w) gefüllt und Differenzwägungen vorgenommen, um Abdampfverluste innerhalb des Untersuchungszeitraumes von 20 Tagen gravimetrisch zu erfassen. Mit Flasche A als Referenz wurde ein Vergleichschromatogramm der Testmischung (Benzo(a)pyren, Benzo(g,h,i)perylen und Indeno(1,2,3c, d)pyren) auf genommen. Nach der Aufnahme des Referenzchromatogramms wurden beide Flaschen bei Raumtemperatur in einem Abzug gelagert, der für einen gleichmässigen Luftstrom über den Flaschen sorgte. Die HPLC-Analyse der Testmischung wurde nach jeweils neun und 20 Tagen wiederholt.

Folgender apparative Set-up wurde für die HPLC-Analyse gewählt:

Es wurde ein von der EZ-Chrom Elite Software gesteuertes VWR-Hitachi LaChrom Elite® HPLC-System mit Diodenarray-Detektor verwendet und isokratische Pumpenbedingungen mit vorgemischter mobiler Phase gewählt. Die stationäre Phase war eine Superspher® 100, RP18eSäule (5 ?m, 125 x 2 mm, Merck Millipore) mit einer Flussrate von 500 ?L/min.

Ergebnisse

Dieses Experiment belegte eindeutig, dass ohne Verwendung von Sicherheitsverschlüssen bereits nach relativ kurzer Zeit Retentionszeitverschiebungen auftreten können. Erwartungsgemäß zeigte Flasche A keine signifikanten Gewichtsänderungen, was darauf schließen ließ, dass keine Lösemitteldämpfe aus der Flasche entwichen waren. Flasche B hingegen wies einen bedeutenden Flüssigkeitsverlust auf, der mit hoher Sicherheit durch Verdampfung verursacht war. Daraus resultierte eine veränderte Zusammensetzung des AcetonitrilWasserGemisches, die wiederum die veränderte Selektivität der mobilen Phase bedingte. Abdampfverluste entstehen in „offenen“ Vorratsflaschen, weil die Dampfdrücke der einzelnen Lösemittelkomponenten verschieden sind und auch Azeotrope gebildet werden können.
Anhand der chromatografischen Ergebnisse konnte festgestellt werden, dass in der „offenen“ Vorratsflasche bedeutend mehr Acetonitril als Wasser verloren gegangen war. Die Retentionszeiten wurden aufgrund der Abnahme des Acetonitril-Anteils im Eluenten verkürzt. Diese Retentionszeitverschiebung kann in Chromatogrammen komplexer Realproben auch eine Verschlechterung der Auflösung bewirken. Hätten diese nicht verschlossenen Lösemittelflaschen nun nicht unter dem Abzug gestanden, dann wäre genau diese Menge Acetonitril innerhalb des Untersuchungszeitraumes in die Luft entwichen. Demzufolge lässt sich schlussfolgern, dass nur fest verschlossene Lösemittelflaschen als Behälter für HPLC-Eluenten verwendet werden sollen, um unkontrollierte Verdampfung von Lösemitteln zu vermeiden. Dies gilt insbesondere bei vorgemischten Eluenten. Bei Verwendung von SafetyCaps wird eine ungewollte Verdampfung verhindert und die Laborluft vor unbeabsichtigter Kontamination durch toxische Verbindungen geschützt, was wiederum den Mitarbeitern zugutekommt [3].

Abhilfe schaffen

SafetyCaps sorgen für die sichere Entnahme von Lösemitteln, ohne dass schädliche Dämpfe nach außen austreten. Die Emissionen organischer Lösungsmittel werden hierbei nachweislich um 73 % reduziert, was dem Schutz der Gesundheit der Labormitarbeiter dient [3]. Eine sichere Entnahme ist über das integrierte Belüftungsventil möglich, das für Druckausgleich während der Entnahme sorgt. Gleichzeitig hält die Ventilmembran Staub- und Schmutzpartikel aus der nachströmenden Luft zurück. Die im Belüftungsventil integrierten Luftfilter garantieren, sofern halbjährlich ausgetauscht, reine Lösemittelqualität. Das Verschlusssystem verfügt über frei drehbare Verschlusskappen, sodass Behälter selbst bei Verwendung mehrerer Anschlüsse ohne Verdrehen der Schläuche schnell gewechselt werden können. Als sehr praktisch haben sich SafetyCaps mit Absperrhahn erwiesen; sie verhindern Lufteinschlüsse im Schlauch, erleichtern das Wechseln der Vorratsbehälter und sind ideal bei Reparaturen oder Wartungsarbeiten am HPLC-System. Bei Wiederinbetriebnahme des HPLC-Systems ist schnelles und einfaches Spülen möglich. Darüber hinaus gibt es SafetyCaps mit Leerstandsanzeige, die anzeigen, wenn der Lösemittelvorrat knapp wird. Speziell für den präparativen HPLC-Betrieb konzipierte SafetyCaps verfügen über ein spezielles Ventil und erlauben Fördermengen von bis zu 400 mL pro Minute.

SafetyWaste Caps für die Lösemittel-Abfallentsorgung

Auch für die HPLC-arbeitsplatzgerechte Entsorgung von Lösemitteln wurde ein ausgeklügeltes Sicherheitsverschlusssystem entwickelt. Die bewährten SafetyWaste Caps leiten die Abfallschläuche der HPLC-Anlage direkt und luftdicht in das Entsorgungssystem. Die Sicherheitsverschlüsse enthalten dazu die erforderlichen Fittings für die Schläuche sowie einen integrierten Abluftfilter mit Aktivkohle- Spezialgranulat, dessen Standzeit von der Belastung durch die adsorbierten Lösemitteldämpfe abhängt. Mit den entsprechenden Sicherheitstrichtern werden die Abfallbehälter lediglich für den Augenblick des Einfüllens geöffnet, ansonsten bleiben sie geschlossen. Die Einbaulösungen für die Lösemittelentsorgung von S.C.A.T.- Europe bestehen aus elektrisch leitfähigem HD-Polyethylen und beugen statischer Aufladung vor. Über zusätzliche Erdungsanschlüsse können sie gesichert werden.

Fazit

Die Lösemittelemissionen werden durch die Nutzung von SafetyCaps deutlich reduziert, sodass eine geringere gesundheitliche Gefährdung fu?r die Mitarbeiter gegeben ist. Weiterhin wird durch die S.C.A.T.- Technologie das Risiko von Lösemittel- Blindwerten in Laboren signifikant minimiert – Lösemittelflaschen bleiben sicher verschlossen. Retentionszeiten – vor allem bei Verwendung vorgemischter Eluenten und isokratischer Arbeitsweise – werden konstant, weil der Eluent nicht verdampfen kann und sich somit die Eluentenzusammensetzung nicht ändert.

Literatur
[1] Für eine ausführliche Beschreibung der möglichen Ursachen für eine veränderte Selektivität, bitte nachlesen unter: https://www.novia.de/hplc-tipps/details/artikel/verschiebung- der-retentionszeit/ und www.kromidas.de. [2] Publikation in VWR ChromJournal Ausgabe 8 Frühling 2010, S. 7 und 14. [3] Die Thematik „Verminderung der Emission durch flüchtige, ungeeignet aufbewahrte Lösemittel und Mitarbeiterschutz ist erschöpfend behandelt in „Sicherheit an jedem Tag im Labor“, S.C.A.T. Europe Katalog 2012, S. VI-IX.