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Gestörte Proteindegradation als Ansatz zur Aktivierung stiller Gencluster

Pilze als Schatztruhe für neue Arzneimittel

von Dr. Jennifer Gerke, Prof. Dr. Gerhard H. Braus

Resistenzen gegenüber etablierten Antibiotika nehmen zu und bedrohen unser Gesundheitssystem. Insbesondere der übermäßige Einsatz von Antibiotika in zahlreichen Lebensbereichen fördert die Ausbreitung gefährlicher multiresistenter Stämme. Die Entdeckung neuer Wirkstoffe ist daher notwendig und erfordert die Entwicklung innovativer Strategien, um die in der Natur vorhandenen Naturstoffe zu identifizieren und zu nutzen.

Sekundärmetaboliten: Schätze der Natur

Sekundärmetaboliten sind eine der für den Menschen bedeutsamsten Erfindungen der Natur. Es handelt sich um niedermolekulare, chemische Verbindungen, die von Bakterien, Pilzen, Pflanzen oder Insekten produziert werden. Sie stellen keine lebensnotwendigen Substanzen dar, sind aber in bestimmten Lebensphasen der Produzenten von Vorteil. Sie können als Signalmoleküle zur Kommunikation, als Schutzstoffe gegen extreme Umweltbedingungen oder als Abwehrstoffe gegenüber Fressfeinden genutzt werden. Der Mensch nutzt manche dieser Naturstoffe schon seit Jahrtausenden als Drogen oder Genussmittel und inzwischen werden zahlreiche Sekundärmetaboliten industriell als Lebensmittelzusätze verwendet. Eine der für die Pharma- und Agrarindustrie wichtigsten Eigenschaften der Sekundärmetaboliten ist ihre Fähigkeit, biologische Aktivitäten auszuüben oder zu beeinflussen. In der Landwirtschaft werden sie aufgrund ihrer antibiotischen Fähigkeiten als Pestizide oder Futtermittelzusatz eingesetzt. In sehr vielen Fällen stellen Sekundärmetaboliten die Ausgangsstoffe oder Synthesevorlagen für Arzneimittel dar. So wurde beispielsweise aus dem Schimmelpilz Aspergillus terreus das cholesterinsenkende Mittel Lovastatin gewonnen. Chinin, das als Vorlage für die synthetische Herstellung eines Malariamittels dient, ist ein aus der Rinde des Chinarindenbaums isoliertes Alkaloid.
Bereits in den 20er-Jahren entdeckte Sir Alexander Fleming eines der bis heute wichtigsten Antibiotika in einer verschimmelten Bakterienkultur, das Penicillin. Die Hälfte der im Zeitraum von 1981 bis 2010 neu zugelassenen Medikamente waren sekundärmetabolitischen Ursprungs, was die Bedeutung dieser Naturstoffe weiter unterstreicht. In den letzten Jahren hat sich ein regelrechter Boom in der Naturstoffforschung entwickelt. Die in Abbildung 1 dargestellte Statistik zeigt, dass gerade im neuen Jahrtausend eine starke Zunahme an Veröffentlichungen in Fachzeitschriften zum Thema Sekundärmetabolismus stattgefunden hat. Allein die letzten drei Jahre umfassen 65 % der im gesamten vergangenen Jahrzehnt verfassten Publikationen. Parallel dazu prognostiziert die Weltgesundheitsorganisation WHO einen dramatischen Anstieg an Resistenzen gegenüber vorhandenen Antibiotika, was die Entdeckung, Entwicklung und Nutzbarmachung neuer Antibiotika unerlässlich macht.

Pilze als Quelle für Naturstoffe

Das faszinierende Königreich der Pilze reicht von einzelligen Hefen über Schimmel bis zu schmackhaften Großpilzen und wird bereits seit Jahrzehnten in der Naturstoffforschung genutzt. Der rasante technische Fortschritt der Sequenzierungstechniken führt dazu, dass immer mehr Pilzgenome entschlüsselt werden. Dabei stellte sich heraus, dass Sekundärmetaboliten durch eine Reihe von Enzymen hergestellt werden, die häufig von nebeneinanderliegenden Genen kodiert werden und somit in so genannten Genclustern organisiert sind. Die Genomik zeigte, dass weit mehr Gencluster zur Biosynthese von Sekundärmetaboliten in den Genomen vorhanden sind als bisher an Sekundärmetaboliten selbst identifiziert wurden. Konservativ geschätzt gibt es mehr als 1,5 Mio. verschiedene Pilzarten auf unserer Erde. Die Mehrzahl aller Pilze hat das Potenzial, mehrere verschiedene Sekundärmetaboliten zu bilden. Hier handelt es sich also um ein bisher kaum genutztes Reservoir für Naturstoffe und damit auch für neue Arzneimittel. Das Geheimnis zur Entschlüsselung dieses Potenzials ist die Zugänglichkeit zu den Biosynthesegenen. Ein Großteil der pilzlichen Gencluster für Sekundärmetaboliten wird von den Organismen unter den standardisierten Laborbedingungen nicht benötigt und ist daher stillgelegt, ein großes Problem für die Naturstoffforschung. Um diesen stillen Genclustern ihre Geheimnisse zu entlocken, wurden in den letzten Jahren verschiedene Techniken erfolgreich entwickelt. Diese lassen sich in zwei übergeordnete Kategorien einteilen: Techniken, mit denen äußere Einflüsse, also z. B. die Wachstumsbedingungen, variiert werden und Techniken, mit denen genetische Veränderungen vorgenommen werden, das so genannte Genetic Engineering. Hier können beispielsweise gezielt Biosynthesegene oder aber Kontrollgene – z. B. für Transkriptionsfaktoren – überexprimiert werden.

Sekundärmetabolismus und pilzliche Entwicklung

Es gibt eine Verknüpfung zwischen unterschiedlichen Entwicklungsstadien eines Pilzes und Unterschieden in der Aktivität von Genclustern für den Sekundärmetabolismus. Ein möglicher genetischer Schlüssel zur Entdeckung neuer Naturstoffe könnte damit die Entkopplung von Sekundärmetabolismus und Entwicklung auf molekularer und genetischer Ebene sein. Inzwischen wurden einige Proteinkomplexe, die sich an der Grenzfläche zwischen beiden Bereichen befinden, in Modellpilzen der Molekularbiologie identifiziert. Drei Beispiele sollen das illustrieren.
(i) Der Velvet-Komplex besteht aus drei Proteinen. Zwei dieser Proteine tragen eine Velvet-Protein-Domäne, die man nur bei Pilzen findet und die dem Komplex den Namen geben. Diese beiden Proteine kontrollieren als Transkriptionsfaktoren die Entwicklung des Pilzes. Das dritte Protein (LaeA) kontrolliert wahrscheinlich über eine Veränderung der Chromosomenstruktur den Sekundärmetabolismus und kann weitere Entwicklungsaufgaben übernehmen. LaeA ist ein universeller Regulator für den pilzlichen Sekundärmetabolismus und steuert u.a. die Expression von Penicillin oder Vertretern der giftigen Aflatoxin-Familie, die von Aspergillen hergestellt werden und Nahrungsmittel ungenießbar machen. Der trimere Komplex aus Velvet-Proteinen und LaeA wird im Kern gebildet und koordiniert dort Sekundärmetabolismus und Entwicklungsvorgänge. Der Komplex, der ursprünglich in Aspergillus nidulans entdeckt wurde, scheint in zahlreichen Pilzen konserviert zu sein. Störungen in diesem Komplex führen sowohl zu Entwicklungsdefekten als auch zu einem fehlregulierten Sekundärmetabolismus.
(ii) Sekundärmetabolismus und Entwicklungsvorgänge eines Pilzes werden durch die Umwelt kontrolliert. Die Signalübertragung erfolgt von der Plasmamembran des Pilzes in seinen Zellkern. Ein weiterer Komplex, der Sekundärmetabolismus und Entwicklung steuert, ist an dieser Signalübertragung beteiligt und besteht aus mehreren Proteinkinasen. Dieses MAP-Kinase- Modul aus drei Kinasen und einem Adapter wandert zwischen der Plasmamembran und dem Kern und aktiviert dort über Phosphorylierung eine der Komponenten des oben erwähnten Velvet-Komplexes. Defekte in diesem Komplex verändern ebenfalls die Fähigkeit des Pilzes, seinen Sekundärmetabolismus mit Entwicklungsvorgängen zu koordinieren.
(iii) Der Abbau von Proteinen scheint für die Koordination von Sekundärmetabolismus und pilzlicher Entwicklung von Bedeutung zu sein. Das 26S-Proteasom baut von Einzellern bis zum Menschen Proteine einer Zelle ab. Abzubauende Proteine müssen dazu über die kovalente Bindung an Ubiquitin zunächst markiert werden. Die Aktivität der entsprechenden Enzyme (Ubiquitin- E3-Ligasen) wird durch einen weiteren Proteinkomplex kontrolliert, der auf diese Weise an der Kontrolle des Proteinabbaus beteiligt ist. Dieser hochkonservierte Multiproteinkomplex ist das COP9- Signalosom (CSN) und besteht aus acht Untereinheiten. Der fünften Untereinheit des CSN-Komplexes – CSN5/csnE – kommt hierbei eine besondere Rolle zu. Diese inaktiviert Ubiquitin-E3-Ligasen durch die Katalyse einer Deneddylierung. Das ist die Entfernung des ubiquitin-ähnlichen Nedd8 von aktiven Ubiquitin-E3-Ligasen. Die Deletion von Genen für CSN-Untereinheiten führt zu gestörter Proteindegradation und damit in höheren Eukaryoten zum frühzeitigen embryonalen Tod. Ein Grund hierfür könnte sein, dass Defekte in der Proteindegradation instabile Proteine wie z. B. Transkriptionsfaktoren stabilisieren und damit die normale Entwicklung behindern. Die Deletion des entsprechenden Gens in filamentösen Pilzen wie A. nidulans führt hingegen zu lebensfähigen Mutanten, die lediglich in Sekundärmetabolismus und Entwicklung verändert sind.

Gestörte Koordination von Sekundärmetabolismus und pilzlicher Entwicklung: Ein Schlüssel zur Aktivierung stiller Biosynthese- Gencluster?

Können Proteinkomplexe, die für die Koordination von Sekundärmetabolismus und pilzlicher Entwicklung notwendig sind, bei der Identifikation von neuen Naturstoffen hilfreich sein? Hierzu wurde das Beispiel des COP9-Siganosoms CSN genauer betrachtet. Bereits mit bloßem Auge erkennt man, dass ein Defekt in der katalytischen Untereinheit (csnE-Deletion) zur Produktion rötlicher Pigmente führt, die an das Nährmedium abgegeben werden. Diese konnten als Orcinol und verwandte Phenylether wie Violaceol I und II, Cordyol C und Diorcinol identifiziert werden. Zusätzlich konnten zahlreiche weitere bereits in A. nidulans bekannte Verbindungen in zum Teil stark vermehrten Mengen im Vergleich zum Wildtypstamm gefunden werden.
Mithilfe einer Microarray-Analyse wurde nach bisher unbeschriebenen Genclustern gesucht, die in der csnE-Deletion im Vergleich zum Wildtyp verstärkt exprimiert werden. Ein Beispiel ist in Abbildung 3B gezeigt (dba-Cluster). Durch gezielte Überexpression des für das Gencluster spezifischen Transkriptionsfaktors (DbaA) trat eine gelbe Verfärbung des Nährmediums auf, wie sie auch in schwächerem Ausmaß in der csnE-Deletion zu sehen war. Der Gencluster beinhaltet neben dem Transkriptionsfaktor eine Polyketidsynthase (DbaI), deren direktes Produkt als 2,4-Dihydroxy-3-methyl-6-(2-oxopropyl) benzaldehyd (DHMBA) identifiziert werden konnte. In einem Agardiffusionstest konnte eine bisher nicht bekannte antibakterielle Aktivität gegen den Keim Micrococcus luteus festgestellt werden. Überraschend war, dass die gezielte Überexpression des dba-Clusters offenbar auch Auswirkungen auf andere Biosynthese- Gencluster innerhalb des Organismus hat. Es konnte eine zweite, für Aspergillus bisher unbeschriebene Substanz identifiziert werden, nämlich das toxische, stickstoffhaltige 3,3-(2,3-Dihydroxypropyl)diindol (DHPDI), dessen Biosynthesegene nicht im dba-Cluster liegen. DHPDI wird zwar vom Wildtyp produziert, tritt aber nicht mehr im gelben dba-Überexpressionsstamm auf, was auf eine Wechselwirkung zwischen der Expression von zwei verschiedenen Clustern schließen lässt, die im Einzelnen noch nicht verstanden ist.

CSN: Ein neuer Weg zu unbekannten Naturstoffen

Die Störung des Proteindegradationsapparates stellt eine neue und interessante Möglichkeit zur Aktivierung stiller Biosynthese- Gencluster und damit zur Identifizierung neuer Sekundärmetaboliten dar. Insgesamt konnten über 100 verschiedene Metabolitenmarker mithilfe einer umfassenden, ungerichteten Metaboliten-Fingerabdruck- Analyse in der csnE-Mutante von Aspergillus nidulans gefunden werden, die unterschiedlich zum Wildtyp reguliert werden [8]. Das Potenzial für die Identifikation neuer Sekundärmetaboliten ist damit selbst in einem Modellpilz bereits vielversprechend. Da es sich bei der fünften CSN-Untereinheit um ein hochkonserviertes Protein handelt, stellt das entsprechende Gen einen guten Angriffspunkt dar, der auch in anderen filamentösen Pilzen zur Aktivierung stiller Gencluster führen sollte und somit als aussichtsreiches neues Werkzeug zur Identifizierung neuer aktiver Biomoleküle eingesetzt werden kann, welche in unserer Gesellschaft immer dringender benötigt werden.

Literatur
[1] Newman, D.J. & Cragg, G.M. [2012] J. Nat. Prod. 75, 311-335. [2] Cooper, M.A. & Shlaes, D. [2011] Nature 472, 32. [3] Hawksworth, D.L. & Rossman, A.Y. [1997] Phytopathology 87, 888-891. [4] Bayram, O. et al. [2008] Science 320, 1504-1506. [5] Bayram, O. & Braus, G.H. [2012] FEMS Microbiol. Rev. 36, 1-24. [6] Bayram, O. et al. [2012] PLoS genet. 8, e1002816. [7] Braus, G.H. et al. [2010] Curr. Opin. Microbiol. 13, 672-676. [8] Nahlik, K. et al. [2010] Mol. Microbiol. 78, 964-979. [9] Gerke, J. et al. [2012] Appl. Environ. Microbiol. 78, 8234-8244. [10] Ahuja, M. et al. [2012] J. Am. Chem. Soc. 134, 8212-8221.

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