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Gene auf Zucker

Entwicklung biobasierter Trägersysteme für den Gentransfer

von Prof. Dr. Dagmar Fischer, Prof. Dr. Thomas Heinze

Der gezielte Transport von DNA und RNA mit Vektoren, meist aus synthetischen Polymeren, ­in Zellkulturen gehört mittlerweile zum festen Repertoire der biologischen Forschung und Entwicklung, was die Vielzahl an kommerziellen Kits zeigt. Allerdings gestalten sich bisher nicht nur viele Laborversuche, sondern vor allem auch der Transfer in die Klinik zur Anwendung am Patienten schwierig, was in vielen Fällen der unzureichenden Verträglichkeit und Abbaubarkeit solcher Träger geschuldet ist. An der FSU Jena werden neue biobasierte, natürliche Systeme aus Polysacchariden entwickelt, die diesen Aspekten Abhilfe verschaffen könnten.

Vektoren zum Transfer von DNA und RNA müssen „Allrounder“ sein, die eine Vielzahl von verschiedenen Aufgaben erfüllen sollen. Sie sollen (i) die Stabilität ihrer Nukleinsäure-„Fracht“ gewährleisten, (ii) die effiziente und möglichst selektive Aufnahme in Zielzellen bewerkstelligen und (iii) eine effiziente Wirkung (Transfektion) bei (iv) gleichzeitig hervorragender Verträglichkeit ermöglichen. Insbesondere im Hinblick auf eine Anwendung am Patienten müssen Sicherheit und Biokompatibilität zwingend gewähr­leistet sein [1].

Dextrane: altbewährte Zucker neu entdeckt

Dextrane sind in Pharmazie und Medizin seit vielen Jahrzehnten erfolgreich unter anderem als Plasmaexpander, Tablettierhilfsstoff und Stabilisator kolloidaler Zubereitungen im Einsatz und daher bezüglich ihrer Toxikologie und Bioverteilung hinreichend bekannt. Die hochmolekularen Biopolysaccharide werden in saccharosehaltigen Medien durch die Aktivität des Enzyms Dextran-Saccharase, das von verschiedenen Leuconostoc-Stämmen produziert wird, biosynthetisch als verzweigtes oder unverzweigtes Molekül gebildet. Dextrane werden im Organismus abgebaut und im Körper verstoffwechselt [2]. Da sie selbst nicht in der Lage sind, mit DNA und RNA zu interagieren, lag die Idee nahe, kationische Seitengruppen kovalent zu binden, die zu einer elektrostatischen Wechselwirkung mit der negativ geladenen DNA und RNA führen [3]. Allerdings bestanden bisher solche Seitenketten oftmals wieder aus synthetischen Polymeren und nicht biogenen Funktionalitäten, die selbst nicht abbaubar oder ausscheidbar sind und teilweise hohe Toxizität aufweisen.

Zucker und Aminosäuren: zwei natürliche Partner

Demgegenüber erscheint es sehr aussichtsreich, natürlich vorkommende Funktionalitäten mit Amin- und Ammoniumgruppen in die Dextrane einzuführen. Auf der Basis der Jenaer Arbeiten zur Polysaccharidchemie sind effiziente Reaktionen unter milden Bedingungen entwickelt worden, die es erlauben, praktisch jede Carbonsäure in Polysaccharide einzuführen [4, 5]. Erstmals gelang die reproduzierbare Herstellung von Dextranaminosäureestern mit kontrollierbarer Molmasse und einstellbarem Gehalt (durchschnittlichen Substitutionsgrad, DS) der Estersubstituenten; eine Synthesevariante, die sich problemlos up-scalen lässt. Dazu werden Aminosäuren mit kommerziell verfügbarem N,N-Carbonyldiimidazol aktiviert und ergeben in einer homogenen Reaktion die korrespondierenden Dextranderivate mit hoher Reinheit und ohne nennenswerten Polymerabbau (der durchschnittliche Polymerisationsgrad, DP des Ausgangsdextrans bleibt erhalten), es entstehen keine toxischen Nebenprodukte. Auf der Basis dieses Synthesekonzeptes ist eine Library von mono- und multifunktionalen Aminosäurestern von Dextranen zugänglich, die darüber hinaus andere funktionelle Gruppen tragen können; ein Baukasten für eine praktisch unüberschaubare Zahl von Dextranderivaten mit bemerkenswerter struktureller Vielfalt. Die bisher ausgewählten Produkte zeigen herausragende Eigenschaften als DNA-Transporter, wobei gegenwärtig ß-Alanin-substituierte Dextrane im Vordergrund des Interesses stehen.

Alaninsubstituierte Dextrane als DNA-Transporter

Alaninsubstituierte Dextrane sind hervorragend wasserlöslich, nach Gefriertrocknung dauerhaft bei Raumtemperatur zu lagern und können rasch und vollständig in Puffern und Zellkulturmedien rekonstituiert werden. In standardisierten Toxizitätstests (nach DIN ISO 10993-5) an L929-Mausfibroblasten zeigten sie hervorragende Verträglichkeiten, die mehr als um den Faktor 2 höher liegen als bei bekannten synthetischen Polymeren wie z.B. den oftmals verwendeten Polyethyleniminen [6]. Untersucht man die Wechselwirkungen mit Blutzellen wie Erythrozyten, die bei Injektion die ersten Kontaktpartner im Organismus sind, sind in therapeutisch relevanten Konzentrationsbereichen keine hämolytischen Effekte oder Aggregationen von Blutzellen zu beobachten, d.h. keine thrombotischen Ereignisse.

Durch einfaches Hinzupipettieren von DNA oder RNA zu den Lösungen der alaninsubstituierten Dextrane bilden sich spontan Komplexe, die innerhalb weniger Minuten einsetzbar sind. Mit einer gesamtkationi­schen Ladung und einer Größe von ca. 100 nm unter optimierten Bedingungen und Ansatzverhältnissen erfüllen die Komplexe alle Voraussetzungen für eine gute Aufnahme über die Zellmembran. Sie sind in serumhaltigen Medien einsetzbar, schützen die Nukleinsäuren gegen enzymatische Angriffe durch Nukleasen des Blutes genauso, wie sie gegen unkontrollierte und unerwünschte Verdrängung der Nukleinsäuren durch Serumproteine stabilisieren. Sie sind in der Lage Säugerzellen zu transfizieren mit der Besonderheit, dass auch bei hohen Dosen keine toxikologisch bedenklichen Effekte zu beobachten sind.

Was bringt die Zukunft?

Eine Anpassung der Komplexe auf Dextran-Alanin-Basis für die jeweilige Anwendung kann nicht nur durch Variation der Herstellungsbedingungen und Variation der Komplexzusammensetzung erreicht werden. Das Konzept lässt sich auf verschiedene kationische Aminosäuren und deren Kombination übertragen. Eigenschaften wie Bindungsstärke der Komplexe mit DNA und RNA, Stabilität, Toxizität und Transfektionseffizienz lassen sich durch Auswahl und Kombination von verschiedenen Aminosäuretypen steuern. Während z.B. Lysin eher für die Bindung von DNA vorteilhaft ist, wirkt sich ein Überschuss an Alanin vor allem positiv auf die Transfektion von Zellen aus. Zusammengefasst bietet die neue Synthesestrategie zahlreiche Ansätze zu Strukturvariationen. Zahlreiche Limitierungen wie unzureichende Bioabbaubarkeit, inakzeptable Toxizität und umständlich durchzuführende Versuchsvorschriften können mit den Aminosäure-modifizierten Dextranen umgangen werden.

Literatur
[1] Schlenk, F. et al. (2013) Ther. Deliv. 4(1), 95?–113
[2] Heinze, T. et al. (2006) Adv Polym Sci 205, 199?–291
[3] Ochrimenko, S. et al. (2014) Carbohydr. Polym. 113, 597?–606
[4] Varshosaz, J. (2012) Expert Opin Drug Deliv. 9(5), 509?–523
[5] Heinze, T. et al.(2006) Springer Verlag Heidelberg, 2006 ISBN 3-540-32103-9
[6] Jaeger M. et al. (2012) Chem. Soc. Rev. 41(13), 4755?–4767

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