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Wie sich Tumoren einer erfolgreichen Arzneimittelbehandlung entziehen

Krebszellen auf der Überholspur?

von Prof. Dr. Christoph A. Ritter

Die Diagnose Krebs ruft in der Regel bei den betroffenen Patienten tiefe Bestürzung und große Ängste hervor. Und dies ist häufig nur zu berechtigt, bedenkt man die Konsequenzen einer solchen Nachricht. Typischerweise werden diese Patienten einer langwierigen und mit gravierenden Nebenwirkungen behafteten zytostatischen Therapie unterzogen. Deren Erfolg ist allerdings bei Weitem nicht garantiert.

Die Tumorzelle verfügt über ein großes Repertoire an Mechanismen, die sie vor den schädigenden Einflüssen von Zytostatika schützt. Die meisten Arzneistoffe, die zur Bekämpfung einer Tumorerkrankung eingesetzt werden, müssen in die Tumorzelle aufgenommen werden. Dort interagieren sie mit Zielstrukturen, die für die Tumorzelle überlebenswichtig sind. Ein Mechanismus der Zytostatika-Resistenz besteht darin, die aktive Konzentration des Zytostatikums in der Zelle zu verringern. Dies kann durch eine Reduktion spezifischer Aufnahmetransporter, durch eine enzymatische Inaktivierung oder eine verminderte Bioaktivierung des Zytostatikums sowie durch eine gesteigerte Aktivität von Auswärtstransportern geschehen. Des Weiteren können qualitative und quantitative Veränderungen der Zielstruktur zu Resistenzentwicklungen führen. Eine vermehrte Bildung des Zielmoleküls kann ebenso eine Wirkminderung verursachen wie eine Veränderung der Struktur des
Zielmoleküls oder die Ausbildung alternativer Stoffwechselwege (Abb. 1).

Aktiver Auswärtstransport von Arzneistoffen

Die Familie der ABC-Transporter kodiert für etwa 50 humane, strukturell verwandte Transmembranproteine. Die wichtigste Gemeinsamkeit der ABC-Transporter liegt in der hoch konservierten ATP-Bindungsdomäne, die für die aktive Transportfunktion unerlässlich ist und der Proteinfamilie ihren Namen „ATP-binding-cassette (ABC)-Transporter“ gegeben hat. Die Transportproteine werden aufgrund struktureller Ähnlichkeiten in die sieben Unterfamilien ABCA bis ABCG eingeteilt. Eine tumorbiologisch interessante Untergruppe stellt die der „Multidrug resistance associated proteins“ (MRPs) der ABCC-Familie angehörenden MRP4 (ABCC4), MRP5 (ABCC5) und MRP8 (ABCC11) dar. Diese Transporter bestehen aus zwei ATP-Bindungsdomänen, die jeweils einer die Membran sechsfach durchlaufenden Transmembrandomäne folgen (Abb. 2A). Sie setzen sich von anderen Vertretern der Transportproteine dadurch ab, dass sie Resistenzen gegen die Zytostatika-Klasse der Antimetaboliten erzeugen [1,2]. Therapieregime, die Antimetaboliten wie 5-Fluoruracil oder Cytarabin enthalten, stellen für einige Tumorarten wie das Pankreaskarzinom oder akute Leukämien eine wesentliche Therapieoption dar. 5-Fluoruracil ist eine wichtige Stütze bei der Therapie des Pankreaskarzinoms. In Überexpressionsmodellen von Pankreaskarzinomzelllinien kann gezeigt werden, dass der bioaktivierte Metabolit 5-Fluordesoxyuridin- monophosphat durch das Transportprotein MRP5 transportiert wird. Dies hat zur Folge, dass sich diese Substanz weniger stark im Inneren von Zellen anreichern kann, die MRP5 besitzen (Abb. 2B) und somit eine geringere zelltoxische Wirkung erzielt wird [3]. In Pankreaskarzinomgewebe findet man das Transportprotein MRP5 in Tumorzellen vor (Abb. 2C), jedoch variiert die Menge dieses Proteins von einem Patienten zum anderen sehr stark. Es ist daher anzunehmen, dass Patienten, deren Tumorzellen geringe Mengen an MRP5 an ihrer Oberfläche tragen, besser auf eine Therapie mit 5-Fluoruracil ansprechen. Wir haben Pankreasgewebe einer kleinen Gruppe von Patienten mit Pankreaskarzinom im Hinblick auf die Anwesenheit von MRP5 in Tumorzellen untersucht, diese Gruppe in solche mit hoher und niedriger Menge an MRP5 unterteilt und beide Untergruppen hinsichtlich ihres Ansprechens auf die Therapie über die Zeit gegenübergestellt.
Das Ergebnis zeigt, dass sich die Untergruppen nicht unterscheiden (Abb. 2D) und somit die Anwesenheit von MRP5 in den Tumorzellen für das Therapieergebnis beim Pankreaskarzinom eine untergeordnete Rolle zu spielen scheint. Um bei erwachsenen Patienten mit einer akuten myeloischen Leukämie das Wachstum von Tumorzellen über einen möglichst langen Zeitraum zu verhindern, werden sie mit dem Zytostatikum Cytarabin behandelt. Dessen bioaktivierte Form Cytarabin-monophosphat konnte als Substrat für das Transportprotein MRP8 identifiziert werden und reichert sich entsprechend weniger in MRP8 exprimierenden Zellen an (Abb. 2E). MRP8 seinerseits kann in unreifen Vorstufen peripherer Blutzellen, die etwa im Rahmen einer akuten myeloischen Leukämie auftreten, gefunden werden (Abb. 2F). Ob also ein Zusammenhang zwischen der Menge an MRP8 in Leukämiezellen und einem Therapieerfolg mit Cytarabin besteht, wurde an einer Gruppe von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie untersucht. Diejenigen Patienten, deren Leukämiezellen geringe Mengen an MRP8 ausbildeten, überlebten die Erkrankung nach Therapie mit einer höheren Wahrscheinlichkeit als Patienten, deren Leukämiezellen große Mengen an MRP8 bildeten (Abb. 2G) [4]. Diese Ergebnisse machen deutlich, dass die Bedeutung von Transportproteinen für die Tumorresistenz stark von der Art des Tumors und den eingesetzten Arzneistoffen abhängt. Ein enger Zusammenhang zwischen Transportprotein und Therapieergebnis ist dann zu erwarten, wenn der Therapieerfolg besonders an die Wirksamkeit eines bestimmten Arzneistoffs geknüpft ist und dieser Arzneistoff exklusiv von einem Transportprotein transportiert wird. Dies trifft nach unserem derzeitigen Kenntnisstand für die Therapie der akuten myeloischen Leukämie mit Cytarabin enthaltenden Therapieregimen zu.
Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Zugänglichkeit der Tumorzelle für den Arzneistoff. Während sich Leukämiezellen zum überwiegenden Teil unmittelbar in der Blutbahn aufhalten, sind Organtumore wie das Pankreaskarzinom von komplexem Gewebe umgeben und damit für Arzneistoffe nicht direkt erreichbar.

Störungen in der Leitung von Wachstumssignalen

Das Wachstum von Tumorzellen wird häufig durch eine Fehlregulation von Wachstumssignalen bestimmt. Eine in diesem Zusammenhang wichtige Gruppe ist die Familie der epidermalen Wachstumsfaktorrezeptoren (ErbB-Rezeptoren). Sie besteht aus vier Mitgliedern, die sich durch das gemeinsame Vorliegen einer intrazellulären Tyrosinkinaseaktivität auszeichnen. Diese wird durch Bindung eines Liganden und Dimerisierung von Rezeptormolekülen ausgelöst. In der Folge werden weitere intrazelluläre Domänen der Rezeptoren transphosphoryliert, was zu einer Rekrutierung verschiedener Adaptorproteine und einer damit verbundenen Initiierung von Signalwegen führt. Letztlich vermitteln die so angestoßenen Signalwege die für die Tumorzelle charakteristischen Wachstumseigenschaften (Abb. 3A). Strategien zur Blockade dieser Signalaktivierung wurden durch die Entwicklung selektiver, gegen die Ligandenbindungsdomäne der Rezeptoren gerichtete Antikörper sowie durch Hemmstoffe der Rezeptor-Tyrosinkinaseaktivität therapeutisch realisiert [5]. Der relativ guten Verträglichkeit dieser Arzneistoffe standen aber schon von Beginn an rasch eintretende Resistenzentwicklungen gegenüber. Das Signalmolekül Akt scheint dabei eine zentrale Rolle zu spielen, da eine durch genetische Mutationen oder durch den Verlust negativ regulatorischer Proteine wie PTEN verursachte Überaktivierung zu einer Wirkminderung von Antikörper und Tyrosinkinasehemmstoff führte (Abb. 3B) [6,7]. Ein weiterer Mechanismus der Resistenzentwicklung ist die Rekrutierung anderer Rezeptoren der Familie zur Bildung so genannter Heterodimere. Untersuchungen an einem Tiermodell, in dem Resistenzen gegen den gegen ErbB2 gerichteten Antikörper Trastuzumab in ErbB2- überexprimierenden Brusttumorzellen erzeugt wurden, zeigten, dass die Rekrutierung und Aktivierung von ErbB1/EGFR in ErbB2/EGFR-Heterodimeren die Hemmung der Signalwege durch den Antikörper vollständig überwinden konnten (Abb. 3C) [8].

Screening-Verfahren zur Identifizierung von Resistenzmechanismen

Es ist in der Regel nur schwer möglich vorherzusagen, wie viele und welche Mechanismen eine Tumorzelle aktiviert, um sich den zelltoxischen Einflüssen eines Arzneistoffs zu entziehen. Zudem kennen wir bisher nur einen Ausschnitt aller möglichen Mechanismen der Resistenzentstehung, sodass Verfahren notwendig sind, die Resistenzmechanismen frühzeitig und zellbiologisch möglichst umfassend identifizieren. Die Entwicklung hoch sensitiver proteomanalytischer Methoden erlaubt inzwischen solche Untersuchungen an Tumorgewebe, Zelllinien und Proteinkomplexen (Abb. 4). So konnten etwa in einem Mausmodell inkomplexe Proteinmuster gefunden werden, die gegen zielgerichtete Arzneistoffe therapieresistente von -sensitiven Tumoren unterscheiden [9]. Ähnlich lassen sich Veränderungen im Proteom als Antwort auf die Behandlung von Zelllinien mit zytotoxischen Arzneistoffen bestimmen [10]. Unsere Arbeitsgruppe beschäftigt sich derzeit mit einer Methode, Wachstumsfaktorrezeptoren mit deren assoziierten Adaptorproteinkomplexen mittels spezifischer Antikörper, die an magnetische Partikel gebunden sind, zu isolieren. Durch die Charakterisierung des Adaptorproteinmusters sollen im Sinne eines systembiologischen Ansatzes Kenntnisse über den Aktivierungsstatus von Signalwegen unter bestimmten biologischen Bedingungen wie etwa einer Resistenzentwicklung erhalten werden.

Fazit

Die möglichen zellulären Mechanismen, die zu Resistenzentwicklung von Tumorzellen beitragen, sind sehr vielfältig und hängen sowohl von der Tumorart als auch von den eingesetzten Arzneistoffen ab. Daher
ist es notwendig, Methoden zu entwickeln, die frühzeitig und gezielt diese Mechanismen identifizieren. Nur so kann der individuelle Patient die für ihn bestmögliche Therapie erhalten.

ritter@uni-greifswald.de

Abb. 1: Schematische Darstellung möglicher zellulärer Resistenzmechanismen. Etliche Zytostatika gelangen erst über einen aktiven Transport in die Tumorzelle (1). Die Höhe der intrazellulären Konzentration wird neben der Aktivität des Einwärtstransporters durch den Grad des Abbaus (2) oder des Auswärtstransports (3) bestimmt. Eine Wirkminderung des Zytostatikums kann zudem durch Überexpression (4) oder Mutation der Zielstruktur (5) oder durch die Bildung einer alternativen Struktur (6) verursacht werden. Gelangt das Zytostatikum an seine Zielstruktur, kommt es zur Auslösung von Apoptose. Dies kann schließlich durch die Aktivierung apoptosehemmender Signale durch die Tumorzelle verhindert werden (7).

Abb. 2: Einfluss von Transportproteinen auf die Therapie von Tumorerkrankungen.

A Angenommene Topologie ausgewählter ABCC-Transportproteine. Die Transporter bestehen aus je zwei transmembranären Domänen (TMD) und nukleotidbindenden Domänen (NBD). NH2 – aminoterminales, COOH – carboxyterminales Ende des Proteins, CHO – Glykosylierungsstelle.
B–D Expression und Einfluss von MRP5 im Pankreaskarzinom.
B MRP5 überexprimierende Pankreaskarzinomzellen (MRP5+) und Vektorkontrollen (MRP5-) wurden mit 100 ?M 5-Fluordesoxyuridin für 20 Minuten inkubiert und die Akkumulation intrazellulären 5-Fluordesoxyuridin-monophosphats (5-FdUMP) bestimmt (n=3).
C Immunfluoreszenzfärbung von MRP5 in Pankreastumorgewebe, Zellkerne wurden mit TOTO®-3-iodid gefärbt (blaue Fluoreszenz), der weiße Balken entspricht einer Distanz von 50 ?M.
D Überlebenskurven nach Kaplan-Meier von Patienten mit MRP5 hoch oder niedrig exprimierendem Pankreastumorgewebe.
E–G Expression und Einfluss von MRP8 in akuten myeloischen Leukämiezellen.
(E) MRP8 überexprimierende Schweinenierenzellen (MRP8+) und Vektorkontrollen (MRP8-) wurden mit 100 ?M Cytarabin für 3 Stunden inkubiert und die Akkumulation intrazellulären Cytarabin-monophosphats (AraCMP) bestimmt (n=3).
F Immunfluoreszenzfärbung von MRP8 in CD34+ Vorläuferzellen, Zellkerne wurden mit TOTO®-3-iodid gefärbt (blaue Fluoreszenz), der weiße Balken entspricht einer Distanz von 50 ?M.
G Überlebenskurven nach Kaplan-Meier von Patienten mit MRP8 hoch oder niedrig exprimierenden akuten myeloischen Leukämieblasten.

Abb. 3: Signalaktivierung durch Rezeptor-Tyrosinkinasen der ErbB-Familie und Mechanismen der Resistenz gegen ErbB-Rezeptor-Tyrosinkinasen gerichtete Arzneistoffe.
A Rezeptor-Tyrosinkinasen werden durch Bindung ihres Liganden an ihre extrazelluläre Liganden-Bindungsdomäne und die dadurch bedingte Dimerisierung aktiviert. Wichtige, durch nachfolgende Rekrutierung von Adaptorproteinen initiierte Signalkaskaden umfassen den Ras/MAP-Kinase-, den STAT- und den PI3Kinase/Akt-Signalweg.
B Die Hemmung der Aktivierung von Rezeptor-Tyrosinkinasen kann durch Antikörperbindung an der extrazellulären Bindungsdomäne oder durch Hemmung der intrazellulären Kinase geschehen. Bei Überaktivierung von Akt durch Verlust des repressorischen PTEN oder aktivierende Mutationen wird dieser Signalweg vom Rezeptor abgekoppelt und ist nun konstitutiv aktiv.
C Die Bildung von Heterodimeren kann zu einer Umgehung der Hemmung einer Rezeptor-Tyrosinkinase durch spezifische Antikörper führen, wenn der rekrutierte Heterorezeptor zusätzlich durch Stimulation aktivierbar ist.

Abb. 4: Proteomanalytische Methoden zur Identifizierung von Mechanismen der Resistenzentwicklung in Tiermodellen, Zelllinien und subzellulären Strukturen.

Literatur
[1] Guo, Y. et al. [2003] J. Biol. Chem. 278, 29509-29514.
[2] Ritter, C.A. et al. [2005] Drug Metab. Rev. 37, 253-278.
[3] Nambaru, P.K. et al. [2011] Drug Metab. Dispos. 39, 132-139.
[4] Guo, Y. et al. [2009] Clin. Cancer Res. 15, 1762-1769.
[5] Ritter, C.A. & Arteaga C.L. [2003] Semin. Oncol. 30, 3-11.
[6] Yakes, F.M. et al. [2002] Cancer Res. 62, 4132-4141.
[7] Bianco, R. et al. [2003] Oncogene 22, 2812-2822.
[8] Ritter, C.A. et al. [2007] Clin. Cancer Res. 13, 4909-4919.
[9] Reyzer, M.L. et al. [2004] Cancer Res. 64, 9093-9100.
[10] Hammer, E. et al. [2010] Proteomics 10, 99-114.