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HILIC - Entwicklung rekombinanter Proteine

Sequenzierung von Glykanen aus Interleukin-4

von Dr. Kai Darsow

Die Entwicklung rekombinanter, therapeutischer Proteine ist ein bedeutender Bereich der biopharmazeutischen Forschung. Rekombinante Proteine können aufgrund posttranslationaler Modifizierungen wie Phosphorylierung oder Glykosilierung eine Mikroheterogenität aufweisen. Da Isoformen unterschiedliche biologische Aktivität und Stabilität aufweisen können, ist eine genaue Charakterisierung der Modifikationen unerlässlich.

Interleukin-4 (IL-4) ist ein multifunktionelles, glykosyliertes Zytokin, das die Proliferation und Reifung von B-Zellen zu Immunglobulin sezernierenden Plasmazellen stimuliert und das Wachstum von T Zellen, Fibroplasten und Endothelzellen fördert. Das Protein besitzt eine N-Glykosilierung als Proteinmodifikation, die beim Eintritt der naszierenden Peptidsequenz in das raue endoplasmatische Retikulum ausgebildet wird. Die über glykosidische Bindung mit Proteinen verknüpften Oligo- und Polysaccharide werden als Glykane bezeichnet. Diese unterscheiden sich hinsichtlich der Art der glykosidischen Bindung, der als Bausteine verwendeten Zuckermonomere, deren Abfolge, Kettenlänge und ihres Verzweigungsgrads. Entsprechend zeichnen sie sich durch eine sehr hohe Diversität der komplex verzweigten Strukturen aus.
Zur erfolgreichen Strukturidentifikation wird daher üblicherweise neben massen-spektrometrischen Analysen die Retention der Glykane an speziellen Amid-Phasen mittels hydrophiler Interaktionschromatographie (HILIC) bestimmt. Nach sequenzieller regio- und enantioselektiver Hydrolyse der glykosidischen Bindungen durch Exoglykosidasen und Derivatisierung werden die resultierenden Glykane über eine TSKgel Amide-80 Phase (Tosoh Bioscience) getrennt. Diese Methode erlaubt die Diskriminierung isobarer Glykoformen, wie a-2,3 oder a-2,6-Sialinierungen und die Differenzierung von a- und b-Formen der glykosidischen Bindung. Die Detektion der Glykane erfolgt nach Vorsäulenderivatisierung über den Fluoreszenzmarker 2-Aminobenzoesäureamid (2-AB), der spezifisch am freien reduzierenden Ende der Glykanstrukturen bindet. Eine Normierung der Retentionszeit auf die homologe Reihe der Dextrane (Glucose Units) über ein Polynom fünfter Ordnung erlaubt die Identifizierung isolierter Glykane anhand einer Datenbank (Glycobase). Vorteile dieser Methode gegenüber anderen klassischen Detektionsmethoden sind: eine gleichzeitige Trennung von geladenen und neutralen Glykanen, die Trennung isobarer Glykanstrukturen, die Quantifizierung einzelner Glykanstrukturen sowie die Verfügbarkeit von Datenbanken.
Für rekombinant in Spodoptera frugiperda (Sf21) produziertes humanes Interleukin-4 wird unter Verwendung der beschriebenen Methode das Glykan A3G3S(3,6,6) als vollständig getrimmte Form identifiziert. Massenspektrometrische Analysen verifizieren die analysierte Glykanstruktur. Im Hinblick auf die klinische Relevanz der Glykansequenzierung von therapeutischen Proteinen fordert das Commitee for Medicinal Products for Human Use entsprechend der Guideline on similar biological products (2005) zukünftig die Analyse post- und cotranslationaler Proteinmodifikationen für eine Neuzulassung in der Europäischen Union. Die Trennung von isolierten Glykanen nach sequenziellem Exoglykosidaseverdau mittels HILIC bietet hierfür eine robuste und einfache analytische Methode.

Abbildung: Kristalline Struktur von humanem Interleukin-4.
Quelle: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:IL4_Crystal_Structure_recombinant.png (07.11.2009)