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Glückliche Zellen – gesunde Menschen

Photonen im Dienste der Gesundheit

von Dr. Karin Schütze

Spektroskopie ist für viele Biologen und Mediziner ein mit Schrecken behafteter Begriff. Von biomedizinischen Wissenschaftlern oder technischen ­Assistenten gefragt, was die Firma CellTool® herstellt, antworteten wir meistens, dass wir ein spezielles Mikro­skopsystem entwickeln, mit dem man Zellen mithilfe der Raman-Spektroskopie ganz einfach und schnell ana­lysieren kann. Sobald die beiden „Unwörter“ Spektroskopie und Raman fielen, konnte man sehen, wie sich die Nackenhaare aufstellten und das Interesse merklich schwand. Dies liegt vermutlich daran, dass die meisten Bio­logen und Mediziner während des Studiums irgendwann einmal von ­Raman-Spektroskopie gehört hatten, sich aber unter den abstrakten Zickzacklinien nichts vorstellen konnten.

Diese erinnerten eher an eine Bergsilhouette und es war kaum nachvollziehbar, dass Raman-Spektren wertvolle Informationen über Materie oder sogar über biologische Proben liefern sollen.

Erstaunlicherweise kann die Raman-Mikroskopie aber tatsächlich unterschiedliche Zellen – lebend oder fixiert – analysieren und identi­fizieren, da sie detaillierte Informationen über das Proteom der Zelle liefert. Wichtig ist es nun, diese „Zickzackdiagramme“ der komplexen ­Raman-Spektren richtig zu interpretieren. Alle Biomoleküle, die sich im ­Laserfokus befinden, tragen zu diesen Raman-Spektren bei, woraus sich ein spezifisches Summenspektrum der Zelle ergibt, das so charakteristisch ist wie ein Fingerabdruck. Besonders hervorzuheben ist, dass die Raman-Mikroskopie völlig zerstörungsfrei arbeitet, weshalb die Zellen für weitere Untersuchun­gen oder zellthera­peutische Anwendun­gen absolut vital und unverändert zur Verfügung stehen.

In der Tat gibt es mehrere sehr komplexe, rein physikalische Methoden, die ihren Weg in die tägliche Routine der klinischen Diagnostik und Therapie gefunden haben – von Ultraschall- und Röntgenuntersuchungen über Magnetresonanz- (MRT), Positronen- oder Emissionstomografie (PET) bis hin zu verschiedenen laser-basierten Behandlungen wie Laser-Lithotripsie oder Laserkorrektur der Cornea (Hornhaut des Auges). Eine derart hochphysikalische Technologie für klinische Untersuchungen könnte die Raman-Spektroskopie ebenfalls werden. Sie könnte beispielsweise den Pathologen bei der Beurteilung der Gewebeschnitte unterstützen [1], oder dazu beitragen, eine individuell auf den Patienten abgestimmte und somit wirkungsvolle Anti-Krebs-Droge zu finden. Der Chirurg könnte Raman-Spektren zur Erkennung der Tumorgrenze für eine minimalinvasive Tumorresektion heranziehen [2]. Zudem können Bakterien anhand ihrer charakteristischen Raman-Spektren identifiziert werden [3], was eine Erkennung pathogener Keime beschleunigen und somit die Behandlung von Sepsis deutlich verbessern könnte.

Jahrzehntelang war die Raman-Spektro­skopie die Domäne von Physikern, Chemikern und Pharmazeuten, die damit die Qualität von Lacken, Metallen, reinen Substanzen oder Verbindungen untersucht und geprüft haben. Sie haben Raman-Spektren von fast allen Materialien, chemischen Substanzen und aufgereinig­ten Biomolekülen vermessen. Niemand hätte damit gerechnet, dass man mit der Raman-Spektroskopie auch biologische Zellen charakteri­sieren kann, die aus Tausenden verschiedenen Molekülen bestehen, die sich zudem in einem ständigen Umsatz befinden, wodurch sich Zusammensetzung und Konzentration kontinuierlich verändern.

Die Vorteile der Raman-Spektroskopie sind ihre extreme Empfindlichkeit sowie die Option, in Flüssigkeiten arbeiten zu können. Dies bietet vielseitige Anwendungsmöglichkeiten in der bio­logischen Forschung und medizinischen Dia­gnostik. Die zerstörungsfreie Analyse sämtlicher zellulärer Bestandteile gibt auf völlig unschädliche Art einen Einblick in den Zellmetabolismus. Auf diese Weise können in der Zelle Änderungen der molekularen Zusammensetzung und des Aktivitätszustands gemessen werden, die im Zusammenhang mit dem Zellzyklus oder der Zelldifferenzierung stehen oder durch Gabe von Drogen bzw. durch Umwelteinflüsse induziert wurden.

Die Raman-Mikroskopie erkennt und charak­terisiert Zellen mit einem hohen Maß an Präzi­sion und Spezifität – ohne Zusatz von biochemischen Markern, Fluoreszenzfarbstoffen, Anti­-körpern oder Beads. Lebende Zellen können direkt im Medium und somit unter normalen Kulturbedingen analysiert werden, sodass sie für nachfolgende Untersuchungen unversehrt zur Verfügung stehen.

Tatsachen und Potenzial

In den vergangenen Jahren erschienen zahlreiche Publikationen, welche die Eignung und die Bedeutung der Raman-Spektroskopie zur Unter­suchung und Erkennung von Zellen eindeutig belegen. Oft arbeitete dabei ein Physiker, der ein Raman-System zur Verfügung hatte, mit einem Biologen oder Mediziner zusammen, der die Proben bereitstellte.

Trotz der vielversprechenden Ergebnisse fand die Raman-Spektroskopie jedoch bisher nicht ihren Weg in die Routine der Zellanalyse und klinischen Diagnostik. Dies ist hauptsächlich auf zusätzliche Präparationsschritte zurückzuführen, die notwendig waren, um die Zellen auf spezielle, spektroskopisch geeignete Träger aufzubringen. Diese waren für eine Routine­arbeit in der Zellanalyse nicht geeignet, da entweder die Zellen darauf nicht wachsen wollten oder eine simultane mikroskopische Beobachtung nicht möglich war. Oder die Objektträger waren schlicht und ergreifend als Verbrauchsmaterial viel zu teuer. Weiterhin war für die Einstellung und Bedienung des komplexen Raman-System die Fachkompetenz eines Physikers notwendig und man benötigte Spezialwissen, um die Raman-Spektren entsprechend verarbeiten und im Sinne einer biologisch relevanten Aussage interpretieren zu können.

„Unmet need“ – Anforderung für die tägliche Routine

Zum Schließen der Lücke zwischen Laborstudien und klinischer Diagnose ist ein „bio-kompa­tibles“ Raman-System gefragt. Biologen, technische Assistenten und Mediziner brauchen ein Werkzeug, das in die Laborroutine integriert werden kann. Interessant wäre ein intuitiv zu bedienendes und leicht anzuwendendes System, das neben den Anforderungen für zellbiologisches Arbeiten auch die Anforderungen an eine routinegemäße Tumordiagnostik erfüllt. Dabei muss es möglich sein, Raman-Spektren von Zellen in den handelsüblichen Kulturschalen oder auf normalen Glasobjektträgern ohne weitere Präparationsschritte messen zu können.

Die Lösung – ein Raman-Mikroskop für Biologen und Mediziner

Dies war unsere Motivation für die Entwicklung des BioRam^® Systems (CellTool, Bernried, Germany) – eines Raman-Trapping-Mikroskops, bei dem die komplexen, Raman-bezogenen Prozesse im Hintergrund ab­laufen. Der Anwender muss kein Raman Experte sein und es besteht für ihn auch keinerlei Notwendigkeit in diese „Blackbox“ einzugreifen. Somit ist die laserbasierte Raman-Mikroskopie nun so einfach wie die Standard- oder Fluores­zenzmikroskopie. Die verwendete Laserwellenlänge von 785nm wird von lebenden Zellen sehr gut toleriert. Es wurden verschiedene Einsätze für Kulturschalen, Multiwellobjektträger und Mikrotiter­platten sowie Halter für bis zu drei Objektträger für serielle Schnitte entwickelt. Die inverse Mikroskopplattform erlaubt ein sicheres und bequemes Arbeiten mit lebenden Zellen – direkt im Medium – ohne Gefahr von Kontamination.

Die Proben werden einfach auf den Mikroskoptisch gelegt und unter Hellfeldbeleuchtung beobachtet. Adhärent wachsende Zellen können für eine automatisierte Spektrenerfassung vorab mit Pins markiert werden. Der Mikroskoptisch bewegt sich mit höchster Präzision von Zelle zu Zelle. Die Fokussierung des Raman-Lasers durch das Objektiv erzeugt einen Fokuspunkt von circa 1m Durchmesser – abhängig von der Strahlqualität des Lasers sowie der numerischen Apertur des Objektivs. Dies ermöglicht es, je nach Experiment und Fragestellung zwischen Nukleus und Zytoplasma zu unterscheiden (Abb.1). Zudem wird durch das Fokussieren des Laserstrahls ein elektromagnetischer Gradient erzeugt, entlang dem sich Mikroorganismen oder Zellen in Suspension zum Laserfokuspunkt hin bewegen, wo sie während der Raman-Messung festgehalten werden (Laser-Trapping). Des Weiteren können vom Anwender vorab ausgewählte Zell- oder Gewebebereiche automatisch abgefahren und vermessen werden.

Die anwenderfreundliche Steuer- und Auswertesoftware ermöglicht einen schnellen Zugang zu der gewünschten spektralen Information über Zellzyklus und Zustand der Zelle. Als spezielle Herausforderung biomedizinischer Fragestellungen mussten wir uns mit der Fluoreszenz handelsüblicher Glasobjektträger auseinandersetzen. Wir haben hierfür einen Algorithmus entwickelt, mit dem der Glashintergrund von den gemessenen Spektren subtrahiert wird. Für die Interpretation der Spektren wurde eine anwendungsspezifische Datenverarbeitungssoftware entwickelt. Die Analyse der Raman-Spektren wird mithilfe gängiger Statistiksoftware, beispielsweise mittels Hauptkomponentenanalyse („Principal Component Analyses“ – PCA) durchgeführt, eines der am häufigsten eingesetzten Softwaremodule für die Analyse spektraler Daten. Die spektralen Daten können in einer Datenbank abgespeichert und zu späteren Vergleichsmessungen herangezogen werden.

Lebende Mikroorganismen

Um zu testen wie das System funktioniert, wurden Mikroorganismen aus der Luft gemessen. Dazu wurde eine Agarplatte für zwei Minuten geöffnet und bei Raumtemperatur über fünf Tage inkubiert (Abb.2A). Ein paar der darauf gewachsenen Kolonien wurden abgeschabt und in einem 0,9%igen NaCl-Puffer aufgenommen. Raman-Spektren einzelner Organismen wurden unter Nutzung des Trapping-Effekts gemessen, mit dem die Individuen im Laser­fokus während der Dauer der Spektrenerfassung arretiert wurden. Die Spektren der untersuchten Proben unterschieden sich deutlich voneinander. Insbesondere die Bakterien der gefärbten Kolonien zeigten deutliche Peaks bei Wellenzahlen (gleichbedeutend mit dem Kehrwert der Wellenlänge), die den Karotinoiden zuzuordnen sind. Der Unterschied dieser Proben mit den dazugehörigen Spektren ist so deutlich, dass man ihn schon mit dem bloßen Auge erkennen kann.

Aber auch Proben, die sich sehr ähnlich sind wie beispielsweise die Bakterienstämme Staphylokokkus aureus und Staphylokokkus epidermidis [5] oder Subpopulation von EHEC-Bakterien können mit der Raman-Spektroskopie eindeutig unterschieden werden. In Abbildung 3 sind die entsprechenden Mittelwertspektren und die dazugehörenden PCA-Analysen (Hauptkom­ponentenanalyse) gezeigt. In den PCA-Plots wird jedes individuell gemessene Spektrum als ein Punkt dargestellt und vom n-dimensionalen Datenraum in einen zwei-dimensionalen Graphen übertragen. Wenn Spektren sich an bestimmten Stellen anhäufen, d.h. „clustern“, bedeutet das, dass sich die untersuchten Populationen von­einander unterscheiden. Die beiden Staphylokokkus-Stämme unterscheiden sich ebenfalls in ihrem Gehalt an Karotinoiden.

Zusammenfassend kann man sagen, dass der BioRam^® lebende Bakterien und Mikroorganismen ohne spezielle Präparation rasch und spezifisch vermessen kann. Somit könnte er in Zukunft ein wertvolles Werkzeug für die schnelle Untersuchung pathogener Keime und zum Test von Resistenzen werden.

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Krebsforschung und Tumordiagnose

Krebs ist eine der häufigsten Todesursachen und bis heute ist noch nicht alles über seine Entstehung bekannt. Derzeit liegt der Schwerpunkt der Forschung auf der Früherkennung entarteter Zellen, um eine Tumorentwicklung von vornherein zu vermeiden. Das Potenzial der Raman-Mikroskopie für die klinische Onkologie wurde von Fenn et al. [6] in einer Zusammenfassung von Raman-Untersuchungen an unterschiedlichen Krebsarten betont. Chen et al. [7] betrachten die Raman-Mikroskopie ebenfalls als vielversprechende klinische Methode für eine schnelle Diagnose menschlicher Erkrankungen – unter der Voraussetzung, dass ein entsprechend einsetzbares Routinesystem zur Verfügung steht.

Wir konnten zeigen, dass der BioRam^® beispielsweise Zellzustände wie Apoptose und ­Nekrose unterscheiden kann. Oder dass sich die Raman-Spektren von Hodgkin-Lymphom-abgeleiteten Zelllinien von denen von Non-Hodgkin-Lymphom stammenden Zelllinien deutlich unter­scheiden [8,9]. Wir konnten mit der Raman-Spektroskopie auch Zellzyklus bzw. Zellschicksal charakterisieren und sogar Tumorsubpopu­la­tionen entdecken, für die es bislang keinen ­Marker gibt. Auch konnte mit der Raman-­Spektroskopie das Einwandern aggressiver Glio­blastomzellen in ein gezüchtetes neuronales Gewebe beobachtet werden [8].

Gehirntumore

Primäre Gehirntumore machen nahezu 5% der Neoplasien (Krebsgeschwüre) beim Menschen aus, circa die Hälfte davon ist bösartig. Die Vielfalt der Gehirntumore ist sehr hoch, wobei gegenwärtig circa 100 Varianten bestimmt werden können. Wir verglichen die Raman-Spektren von zwei sehr unterschiedlichen Gehirntumoren, einem Meningeom und einem Astrozytom. Kurz zusammengefasst wurden routinemäßig behandelte und in Paraffin eingebettete Tumorproben jeweils in 5m dicke Scheiben geschnitten, entparaffiniert und ins Raman-Mikroskop eingelegt. Von jeder Gewebeprobe wurden mindestens 40 Raman-Spektren gemessen und analysiert. Wir fanden deutliche Unterschiede zwischen den Spektren von Meningeomen und denen von Astrozytomen (Abb.4A und 4B). Diese Ergebnisse zusammen mit den Berichten anderer Wissenschaftler [10] zeigen deutlich das Potenzial der Raman-Spektroskopie zur Erkennung unter­schied­licher Gehirntumorarten. Insbesondere könnte die Raman-Spektroskopie operations­begleitend einen wertvollen Beitrag liefern und den Gehirnchirurgen bei der Entscheidung unterstützen, wie weit er schneiden soll.

„Monitoring“ der Wirksamkeit von Wirkstoffen

Weiterhin wollten wir die Empfindlichkeit der Raman-Spektroskopie untersuchen, um die Aufnahme von Medikamenten in Krebszellen zu verfolgen. Deshalb wurden die HER2-Rezeptor-positiven Brustkrebszellen SKBR3 mit dem Anti­krebsmedikament Herceptin, das gegen den HER2-Rezeptor gerichtet ist, behandelt (20g/ml). Die Raman-Spektren der Zellen mit unterschiedlicher Behandlungsdauer gruppieren („clustern“) in verschiedenen Bereichen (siehe Abb.5B). Die Suche nach den Hauptunter­schieden in­nerhalb der untersuchten Gruppen ergab drei Wellenzahlbereiche, die Amid I (bei Wellenzahl 1.660cm^-1), Lipide und Proteine (bei Wellenzahl 1.450cm^-1) sowie Phenylalanin (bei Wellenzahl 1.003cm^-1) repräsentieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Raman-Spektroskopie interne ­Veränderungen des Zellstoffwechsels als Reaktion auf die Gabe von Wirkstoffen und Medikamenten oder auch von Zellgiften verfolgen und sogar die Moleküle definieren kann, die für die Veränderung verantwortlich sind.

Abb.4 Vergleich der Raman-Spektren (A) von 40 verschiedenen Zellen aus in Paraffin eingebetteten und entparaffinierten Gewebeschnitten eines Astrozytom-Tumors Grad II (blau) und eines Meningeom-Tumors Grad I (rot). (B) Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) der Raman-Spektren zeigt eine klare Trennung der zwei Populationen. (C) Die dazugehörenden Gewebeschnitte der Tumore sind mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt (HE).

Potenzial für die klinische Praxis

Diese Untersuchungen weisen deutlich darauf hin, dass die Raman-Spektroskopie ein enormes Potenzial hat, die klinische Diagnostik zu unterstützen, bei der minimalinvasiven Chirurgie zu assistieren oder die Suche nach einer patientenspezifische Thera­pie zu erleichtern. Durch Einsatz dieser „label-freien“ und nichtinvasiven spektroskopischen Methode könnten Krebszellen früher erkannt und sogar unbekannte Arten von Tumorzellen gefunden werden, die aufgrund fehlender ­Marker bisher nicht entdeckt werden konnten. Weitere Forschungsarbeiten und Untersuchungen müssen durchgeführt werden, um Zuver­lässigkeit dieser vielversprechen­den Technik prüfen und das Vertrauen der ­Anwender gewinnen zu können. Es muss untersucht werden, wie früh die Raman-Spektroskopie Tumorzellen entdecken kann, wie exakt die Tumorklassifizierung ist und wie genau ein ­Tumorstadium zugeordnet werden kann. Das nun zur Verfügung stehende „zell-und anwenderfreundliche“ BioRam^®-System sowie die Möglichkeit, Raman-Analysen von Zellen und Gewebe in unserem ServiceLabor durchführen zu können, dürfte die Akzeptanz und die Einführung dieser vielseitig einsetzbaren Technologie in die klinische Routine sehr erleichtern.

Abb.5 Beobachten (Monitoring) der Herceptin-Aufnahme. (A) Hellfeld-Bilder von SKBR3-Tumorzellen. Die Pins zeigen die Stellen, an denen die Raman-Spektren aufgenommen wurden. (B) PCA-Plot der unbehandelten Kontrollgruppe (blau) und von zwei Zeitpunkten: nach zwei Stunden (rot) bzw. acht Stunden (grün) Inkubation. Die deutliche Anhäufung „Clusterbildung“ zeigt, dass die Zellen auf die Herceptin-Behandlung reagieren und sich die molekularen Eigenschaften entsprechend ändern.

Danksagung

Dank geht an Dr. Christian Kölsche, Dr. Felix Sahm und Dr. P.O. ­Frappart, Pathologisches Institut der Universität Heidelberg und Kli­nische Kooperationseinheit Neuropathologie, Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidel­berg für die Bereitstellung von Gehirn­tumorproben. Wir danken auch Dr. Wolfgang Mutter, Hyglos GmbH, Bernried für die Bereitstellung von EHEC-Bakterien sowie Dr. ­Katharina Malinowsky für die Hilfe im Hinblick auf die Brustkrebszellen. Besonderen Dank gilt Dr. Steffen Koch für seine kompetente Unterstützung bei der Messung und Auswertung der Raman-Spektren. Dieses Projekt wurde gefördert vom 7. Rahmenprogramm der Europäischen Union für Forschung, technologische Entwicklung und Darstellung unter der Fördervereinbarung Nr. 279288 sowie von ­„Photonics4Life“ (P4L Fördernummer 224014m)

Literatur

[1] Diem, M. et al. (2013) J. Biophotonics 6, 11–12, 855–886
[2] Mayerhöfer, T. et al. (2014) Labor&More, 3.14 45–48
[3] Bolwien et al. (2008) Biomedical Optical Spectroscopy, Proc. of SPIE, 6853, 68530F,
[4] Neugebauer, U. et al. (2014) J. Biophotonics 7, 3–4, 232–240
[5] Schütze, K. et al. (2013) Photonics Lasers Med 2(4): 364–366
[6] Fenn, MB. et al.(2011) Adv Opt Technol 213783
[7] Chen, P. et al. (2011) Anal Methods 3, 1257–69.
[8] Koch, S. et al. ( 2013) Proc SPIE;8798: 87980J.
[9] Brauchle, E. et al. (2014) Nature, Scientific Reports, 4, 4698
[10] Gajjar, K. et al. (2013), Anal. Methods 5, 89–102

Bild: CellTool GmbH
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biomedizinischen Wissenschaftlern, Ultraschall- und Röntgenuntersuchungen, Positronen- oder Emissionstomografie, Laser-Lithotripsie, Laserkorrektur, Raman-Spektroskopie, Raman-Spektro­skopie, Zellmetabolismus, Raman-Mikroskopiesystem, Fluoreszenz, Mikroorganismen, Staphylokokkus epidermidis, Krebsforschung und Tumordiagnose, Non-Hodgkin-Lymphom, Tumorsubpopu­la­tionen, Glio­blastomzellen, Gehirntumore, Astrozytom,