Erythropoiesestimulierende Substanzen und Wachstums hormonreleasing Peptide

Neue Herausforderungen

von Prof. Dr. Mario Thevis, Prof. Dr. Wilhelm Schänzer

Dopingprävention stellt ein umfangreiches und komplexes Unterfangen dar, das viele verschiedene Ansatzpunkte erfordert, um den Missbrauch von Substanzen zur illegalen Leistungssteigerung zu mini mieren. Ein Aspekt ist dabei die zeitnahe Entwicklung von Nachweisverfahren zur Bestimmung neuer, (noch) nicht zu gelassener Präparate in frühen oder fortgeschrittenen klinischen Testphasen, die aufgrund ihres Wirkungs profils Missbrauchspoten zial besitzen.

Sowohl durch Geständnisse überführter Athleten als auch mithilfe stetig verbesserter analytischer Verfahren sind zahlreiche Fälle des illegalen Einsatzes von Erythropoietin (EPO) und humanem Wachstumshormon (hGH) in der Vergangenheit bekanntgeworden, die das Ausmaß des Medikamentenmissbrauchs dieser Peptidhormone erahnen lassen. Wachsende Kontrolldichte und weiter führende Forschungen im Antidoping-Kampf haben die Zeit fenster einer möglichen missbräuchlichen Einnahme dieser Substanzen empfindlich limitiert, sodass nicht auszuschließen ist, dass betrügerische Athleten Alternativen suchen. Zu solchen potenziellen Alternativen in Bezug auf EPO und hGH zählen so genannte Erythropoiese-stimulierende Verbindungen (erythropoiesisstimulating agents, ESAs) und Wachstumshormon-releasing Peptide (growth hormone releasing peptides, GHRPs), die im Allgemeinen strukturell unabhängig von den ursprünglichen Peptidhormonen sind. Das Prinzip dieser Präparate beruht nicht auf der Supplementierung eines defizitären Hormonspiegels mit dem entsprechenden Hormon, sondern auf der Steigerung der körpereigenen Produktion bzw. Ausschüttung von EPO und hGH. Daraus resultieren für die Dopinganalytik neue Herausforderungen, da „konventionelle“ Tests hinsichtlich EPO- und hGH-Missbrauch den Einsatz rekombinanter, künstlicher (und somit nicht human-identischer) Hormone berücksichtigen und nicht die strukturfremden Mimetika erfassen. Daher sind komplementäre Strategien erforderlich, welche die Analytik von ESAs und GHRPs im Rahmen routinemäßiger Dopinganalysen erlauben, die überwiegend auf chromatografisch-massenspektrometrischen Methoden basieren. Beispiele moderner Entwicklungen sind im Folgenden dargestellt.

Erythropoiese-stimulierende Substanzen (ESAs)

Zu den ESAs zählen laut Verbotsliste der Welt Anti-Doping Agentur (WADA) neben Erythropoietinen zahlreiche weitere Verbindungen wie z.B. das EPO-Mimetikum Hematide (Peginesatide, Abb. 1, 1) und so genannte Hypoxie-induzierbarer Faktor (HIF)-Stabilisatoren wie beispielsweise FG-2216 (Abb. 1, 2). Obwohl beide (Hematide und FG-2216) noch keine Zulassung als Arzneimittel erhalten haben, sind Spekulationen über einen Missbrauch im Sport seit einiger Zeit gegeben und deren Nachweis im Sinne präventiver Anti-Doping- Maßnahmen erforderlich. Daher sind kürzlich ergänzende Methoden zur Bestimmung dieser Substanzen etabliert worden, die sich aufgrund der deutlich verschiedenen physiko-chemischen Eigenschaften der Zielanalyten in Probenmatrix, Probenvorbereitung und Messung unterscheiden.
Bei Hematide (Abb. 1, 1) handelt es sich um ein homodimeres Peptidhormon, das an einen 2 x 20 kDa Polyethylenglykol (PEG) Träger kovalent gebunden ist und insgesamt ein mittleres Molekulargewicht von ca. 44750 Da erreicht. In klinischen Studien, die inzwischen zum Abschluss der Phase-III geführt haben, wurde die Effektivität des Präparats bezüglich der Steigerung der Produktion roter Blutkörperchen belegt und Plasmakonzentrationen von mehr als 1 ?g/mL bei therapeutischer Dosierung angegeben, die schließlich als Anhaltspunkt für eine erforderliche Sensitivität von Nachweisverfahren angenommen wurden. Aufgrund der nichtnatürlichen und besonderen Primärstruktur des peptidischen Anteils und der Anwesenheit künstlicher Aminosäuren wie z.B. Naphthylalanin stellt Hematide eine xenobiotische Substanz dar, die in Dopingkontrollproben nur nach Verabreichung des Medikaments auftreten sollte. Daher wurde zur Detektion von Hematide nicht die intakte Verbindung als Zielsubstanz gewählt sondern ein proteolytisches Bruchstück, dessen Analytik mittels Flüssigkeitschromatographie und hochauflösender/hochakkurater Massenspektrometrie [LC-MS(MS)] deutlich einfacher erfolgen kann. Zur Bestimmung von Hematide sind gegenwärtig 100 ?L Plasma oder Serum erforderlich, die einer Proteinfällung mittels Acetonitril unterzogen werden. Aufgrund des PEG-Anteils des Hematides verbleibt die Zielsubstanz dabei in Lösung und die hoch-abundanten präzipitierten Proteine können durch Zentrifugation abgetrennt werden. Durch einen enzymatischen Abbau der in Lösung befindlichen Peptide und Proteine mithilfe von Subtilisin wird ein diagnostisches Pentapeptid (GPITNal) generiert, das nach weiterer Reinigung durch eine schwache Kationentauscher-Festphasenextraktion mittels LC-MS(/MS) identifiziert werden kann. Ein typisches Chromatogramm und das zugehörige Produktionenspektrum sind in Abbildung 2 dargestellt, das bei einer Plasmakonzentration von 10 ng/mL aufgenommen wurde. Die Methodencharakterisierung hat eine Nachweisgrenze des Verfahrens von 1 ng/mL ergeben, womit eine effiziente und retrospektive Dopinganalytik bezüglich dieses neuen Produkts gewährleistet ist. Da eine deutlich höhere Anzahl Urinproben als Blut- oder Serumproben im Anti-Doping-Kampf bereitgestellt werden, ist ein weiteres Ziel der Forschung, einen ähnlichen Nachweis auch mittels Urinanalytik führen zu können. HIF-Stabilisatoren wie beispielsweise FG-2216 (Abb. 1, 2) nutzen ein anderes Prinzip, um ähnliche therapeutische Ergebnisse wie EPO oder EPO-Mimetika zu erzielen, nämlich die Zahl roter Blutkörperchen zu erhöhen. Mithilfe von niedermolekularen Enzyminhibitoren wie FG- 2216 wird der Abbau von HIF im Organismus reduziert, sodass eine erhöhte Expression des EPO-Gens ermöglicht wird. Präparate wie FG-2216 sind oral verfügbar und sollten nach Verabreichung sowohl im Blut als auch im Urin als intakte Verbindung sowie als Metabolite nachzuweisen sein, von denen wahrscheinliche Kandidaten in In-vitro-Metabolismusstudien synthetisiert wurden.
Aufgrund der hohen Protonenaffinität des FG-2216 wurde auch hier ein analytischer Ansatz gewählt, der auf LC-MS(/MS) basiert und mit Routineprozeduren der Dopinganalytik für Urinproben kompatibel ist. Zahlreiche Analyten, die im Rahmen von Dopingkontrollen bestimmt werden, können heutzutage durch direkte Urininjektion in LC-MS/MS-Systeme sensitiv erfasst werden. Auch HIF-Stabilisatoren, basierend auf der Grundstruktur des FG-2216, werden auf diese Art gegenwärtig analysiert, wie beispielhaft in Abbildung 3 dargestellt ist. Hier sind das Produkt-Ionenspektrum des FG-2216 aufgeführt sowie die spezifischen extrahierten Ionenchromatogramme eine Urinprobe, die mit 40 ng/mL angereichert wurde. Nachweisgrenzen solcher Verbindungen wurden in Methodenvalidierungen zwischen 0.6 und 10 ng/mL bestimmt, was im Hinblick auf zu erwartende Urinkonzentrationen von bis zu mehreren 100 ng/mL nach therapeutischer Applikation als ausreichend angesehen werden kann.

Wachstumshormon-releasing Peptide (GHRPs)

Neben der Möglichkeit des Missbrauchs von hGH muss auch der illegale Einsatz entsprechender releasing-Faktoren in der Dopinganalytik berücksichtigt werden, da Studien belegt haben, dass Präparate wie GHRP-2 (Pralmorelin, Abb. 1, 3) sowohl kurzfristig die körpereigene hGH Ausschüttung um ein Vielfaches steigern können als auch auf diese Art die Verabreichung rekombinanten hGHs verschleiern. Es existiert eine Vielzahl von GHRPs, von denen GHRP-2 das derzeit einzige zugelassene Produkt darstellt. Viele dieser GHRP-Präparate basieren auf einer Oligopeptid- Struktur, deren Wirksamkeit sowohl nach oraler als auch intravenöser Gabe belegt ist. Die vergleichsweise geringe Menge, die im therapeutischen Einsatz verabreicht wird, resultiert in einer minimalen urinären Ausscheidung der intakten GHRPs, sodass sowohl eine Kationentauscher-Festphasenextraktion von Dopingkontroll-Proben als auch die Erfassung von Metaboliten als notwendig erachtet wurde. Die Extraktion von 2 mL Urin erlaubt beispielsweise die Bestimmung des GHRP-2 Metaboliten D-Ala-D-?Nal-Ala, der durch die nicht-natürliche Aminosäurekombination als Produkt der Verabreichung von GHRP-2 identifiziert wird. Unter Anwendung eines isotopenmarkierten internen Standards dieses Analyten konnte somit ein Verfahren erstellt werden, dass 8 verschiedene GHRPs und den bekannten Metaboliten des GHRP-2 mit LC-MS(/MS) erfasst. Bedingt durch bislang fehlende Informationen zum Stoffwechsel der anderen Oligopeptide wird die Analytik im full scan mit hochauflösender/hochakkurater MS durchgeführt, bei der die so genannte all ion fragmentation zum Einsatz kommt. Auf diese Weise können die gewonnenen Daten ggfs. auch retrospektiv auf derzeit unbekannte Verbindungen untersucht werden.
Ein Beispiel einer Urinprobenanalyse nach oraler Verabfolgung von 10 mg GHRP-2 ist in Abbildung 4 dargestellt.

Foto: © Prof. Dr. Mario Thevis