Der Einfluss von Wasser und Magnesium auf die Struktur von Ribonukleinsäuren

Aufklärung im All

von Dr. Charlotte Förster, Dr. André Eichert, Dr. Markus Perbandt, Prof. Dr. Christian Betzel, Prof. Dr. Volker Erdmann

In jüngster Zeit stehen immer mehr so genannte noncoding Ribonukleinsäuren (ncRNA) im Blickfeld der biochemischen und molekularbiologischen Forscher. Nicht nur das, auch die Mediziner haben bereits ihr Augenmerk auf diese Moleküle mit ihren vielen strukturellen und funktionellen Möglichkeiten gerichtet. Noncoding RNA-Moleküle sind RNA-Moleküle, die keine Informationsträger sind und sich daher ganz eindeutig von den Boten-RNAs (mRNAs) in der Zelle unterscheiden.

Somit ist nach der Entdeckung der Ribozyme durch S. Altman und T. Cech ein weiterer Beweis dafür gegeben, dass das von F. Crick postulierte zentrale Dogma der Molekularbiologie (Abb. 1) nicht länger haltbar ist. RNA-Moleküle können nicht nur Informationsträger und molekulare Scheren (Ribozyme) sein, sondern auch als Aptamere hochaffine Eigenschaften annehmen, die durchaus mit denen von Antikörpern vergleichbar sind. Somit haben RNA-Moleküle alle Grundeigenschaften, die für eine lebende Zelle benötigt werden.

Die jüngsten Genomsequenzierungsergebnisse sind höchst interessant. So besitzt das Bakterium die genetische Information für 5.000 Proteine, die Pflanze für 38.000 Proteine und der Mensch für 21.000 Proteine. Überraschend ist auf jedem Fall die beinahe doppelt so große Anzahl an Proteinen bei der Pflanze als beim Menschen. Natürlich würde man mit all den Fähigkeiten, die dem Menschen im Vergleich zu einer Pflanze zur Verfügung stehen, erwarten, dass diese Zahlen umgekehrt wären. Es ist daher naheliegend, dass neben den Proteinen auch noch andere Moleküle eine entscheidende Rolle für die lebende Zelle spielen müssen. Dass diese Fakten etwas mit der Beobachtung zu tun haben könnten, nach der beim Menschen nur 1.4 % des genetischen Materials für Proteine codieren und die restlichen 98.6 % für noncoding DNAs, bei der Pflanze 30 % für Proteine und 70 % für noncoding DNAs und bei dem Bakterium 95 % für Proteine und nur 5 % noncoding DNAs, erscheint plausibel. Beim derzeitigen Stand der Forschung gehen wir davon aus, dass die Chromosomen des Menschen für 100.000 bis 200.000 verschiedene ncRNAs codieren. Diese – auch microRNAs, siRNAs, shRNAs usw. genannt – regulieren in der Zelle die Expression der verschiedenen mRNAs, indem sie als kurze, 20 bis 30 Basenpaare lange doppelsträngige RNA Moleküle mit bestimmten Proteinen einen Komplex bilden, der dann sequenzspezifisch an der mRNA bindet. Es sind dann die RNA-Proteinkomplexe, die mithilfe der RNA-Komponenten durch Watson-Crick-Basenpaarungen sequenzspezifisch an der mRNA binden, diese spalten und dadurch zum Abbruch der Proteinbiosynthese führen. Diese hochinteressanten Vorgänge führen dazu, dass nun die noncoding RNAs, aber auch Aptamere und die von uns entwickelten Spiegelmere für Möglichkeiten eines medizinischen Einsatzes untersucht werden. Um aber diese vielseitigen Funktionen der RNA-Moleküle besser verstehen zu können, ist es wichtig, dass deren Strukturen auf atomarer Ebene verstanden werden. Aus diesem Grund haben wir uns seit Jahren mit der Kristallisation und Röntgenstrukturanalyse von RNA-Molekülen befasst. Die hier zusammengefassten Strukturergebnisse basieren auf mehr als 250.000 Kristallisationsansätzen und 17 Kristallisationsexperimenten unter Bedingungen der Schwerelosigkeit (Abb. 2).

RNA-Molekule benotigen Wasser und Metallionen

Von entscheidender Bedeutung für das Überleben und Wohlergehen jeder Zelle und jedes Organismus ist die korrekte Weitergabe und Umsetzung der in der Basenabfolge der DNA gespeicherten Information. Die Übersetzung der Nukleinsäureinformation einer mRNA in ein aus Aminosäuren aufgebautes funktionsfähiges Protein erfolgt am Ribosom, einem aus 300.000 Atomen bestehenden Komplex aus Nukleinsäuren und Proteinen. Das Ribosom stellt während des Prozesses der Proteinbiosynthese die Fabrik dar, in der alle Vorstufen und Informationen zur Herstellung eines Proteins zusammengeführt werden. Das Bindeglied zwischen dem genetischen Code aus 64 verschiedenen Basentripletts und dem Alphabet der 20 natürlichen Aminosäuren sind die Transfer-RNAs (tRNAs) – die einzigen Moleküle, die beide Seiten des genetischen Codes „kennen“, wie Francis Crick bereits 1955, lange vor der Entdeckung der tRNAs schrieb. Die tRNAs bestehen aus ca. 80 Nukleotiden und liegen in der Sekundärstruktur als Kleeblatt vor, während die räumliche Struktur dieser Moleküle die Form eines „L“ einnimmt [1]. Sie lassen sich in verschiedene Domänen einteilen, von denen vor allem der Anticodonarm und der Akzeptorstamm von wesentlicher Bedeutung für die Funktion sind. Der Anticodonarm „erkennt“ die auf der mRNA gespeicherte Information und der Akzeptorstamm trägt am 3‘-Ende die entsprechende Aminosäure. Mittels hochauflösender Röntgenstrukturanalyse ist es möglich, die Lage eines jeden einzelnen Atoms eines Moleküls im Raum zu bestimmen. Da bei dieser Methode mit kleineren Molekülen größere Auflösungen erreicht werden, eignen sich vor allem tRNA-Domänen für Untersuchungen von Strukturdetails wie Wassermolekülen und Ionen, die mit der Nukleinsäure assoziieren und essenziell für deren Funktion sind.

So ist Wasser, das mehr als 70 % des Volumens eines menschlichen Körpers ausmacht, das universelle Lösungsmittel aller terrestrischen Organismen. Das bedeutet, dass auch biologische Makromoleküle in wässriger Lösung vorliegen, was von entscheidender Bedeutung für deren Struktur, Funktion und Wechselwirkung mit anderen Molekülen ist (Abb. 3 und 4). In gleicher Weise wichtig für die Funktion vieler biologischer Moleküle sind Metallionen, wie sie auch als Spurenelemente essenzieller Bestandteil der Ernährung sind. So benötigen viele Enzyme Magnesium, um ihre Funktionen ausüben zu können. Die hochauflösende Röntgenstrukturanalyse von tRNA-Akzeptorstammdomänen lieferte Ergebnisse, die auch für die Funktion des Ribosoms auf eine wichtige funktionelle Rolle von Magnesiumionen hindeuten [2, 3].

Modifizierte Nukleinsauren

Modifizierte Nukleinsäuren haben einen hohen Stellenwert im klinischen und therapeutischen Einsatz. Natürliche Nukleinsäuren wie RNA oder DNA werden als Antisense-, microRNAs, Aptamere oder Spiegelmere entwickelt, um gegen Zielmoleküle in der Zelle eingesetzt zu werden. Da allerdings die natürlichen DNA- bzw. RNA-Moleküle nukleasesensitiv sind bzw. oft sehr niedrige Thermostabilität besitzen, ist die Entwicklung modifizierter Nukleinsäuren sehr wichtig. Diese chemisch veränderten Moleküle müssen Eigenschaften der natürlichen Nukleinsäuren weitestgehend beibehalten sprich, sie müssen in ihrer Struktur ähnlich sein, sie müssen in der Lage sein, die gängigen „Watson-Crick“- Basenpaarungen eingehen zu können und sie müssen weiterhin mit den Zielmolekülen in der Zelle in Wechselwirkung treten können. Allerdings dürfen sie nicht für die Zelle toxische Eigenschaften besitzen. Innerhalb der letzten Jahre wurde viel Wert auf die Entwicklung von Nukleotid-Analoga gelegt. Ein sehr viel versprechendes Beispiel ist die so genannte Familie der „locked“ Nukleinsäuren. Substituiert man RNAs mit „locked“ (LNA)-Bausteinen, die die so genannte 2’-O-4’C-Methylen-?-D-Ribofuranose-Modifikation enthalten, wird eine große Steigerung der Thermostabilität beobachtet [4]. Wir haben nun erstmalig die Kristallstruktur einer LNA-Doppelhelix bestimmen können [5]. Die Struktur zeigt eine Nukleinsäure-Geometrie, die mit keiner natürlichen Nukleinsäure in Einklang gebracht werden kann (Abb. 5), sondern eher der Geometrie von anderen Rückgrad-modifizierten ähnelt wie der Geometrie der Glykol-Nukleinsäuren (GNAs), der Peptid-Nukleinsäuren (PNAs) oder der Homo-DNAs. Die Abweichungen in der LNA-Helix gegenüber einer RNA-Helix werden durch Änderungen einzelner lokaler helikaler Parameter hervorgerufen. Im Vergleich zu RNA sind der helikale Twistwinkel, der Rollwinkel und der Propellertwist verkleinert. Dies führt insgesamt zu einer Vergrößerung der großen Furche, die in LNA-Helices Werte um die 24-25 Å im Durchmesser gegenüber 16 Å in Standard-RNA-Duplex-Molekülen zeigt. Andererseits verkleinert sich die kleine Furche, die 15 Å im Vergleich zu 19 Å in RNAs beträgt. Diese Parameter führen zu einer großen, weiten Öffnung in der Mitte der LNA, betrachtet man das Duplex entlang der helikalen Achse (Abb. 5). Die Stabilität der LNA ist eine Konsequenz der chemischen Eigenschaften des Zuckers, der in der 2’- exo conformation „gelocked“ ist. Interessant ist ebenfalls, dass das Hydrationsmuster von RNA und LNA vergleichbar ist.

„Spiegelmere“

Viele in der Natur vorkommende Moleküle existieren in zwei Formen – als Bild und als Spiegelbild. Die Existenz zweier räumlicher Varianten mit gleicher chemischer Zusammensetzung, die sich wie linke und rechte Hand zueinander verhalten, wird Chiralität oder auch Händigkeit genannt. Die „richtige“ Chiralität ist für viele Lebensprozesse von entscheidender Bedeutung. Das betrifft insbesondere Aminosäuren und Nukleinsäurenwie auch in Folge synthetisch hergestellte Medikamente. Der Contergan-Skandal hat uns die Bedeutung der Chiralität bei dem Wirkstoff Thalidomid auf besonders tragische Weise vor Augen geführt. Zwei Formen können also vollkommen andere Wirkungen entfalten.
Die Natur hat auch eine ausgesprochene Vorliebe für jeweils eine Form. So sind Proteine aus „linksgängigen“ L-Aminosäuren aufgebaut, unsere Erbsubstanz hingegen aus „rechtgängigen“ Nukleinsäuren. Wie kam es zu dieser Prävalenz? War die Auswahl rechts- oder linksgängiger molekularer Strukturen nicht rein zufällig, dann muss die Chiralität in einem frühen Stadium der Entwicklung des Lebens auf diesen Planeten beeinflusst worden sein. Unsere Versuche zeigen, dass die rechtsdrehende Ribonukleinsäure (D-RNA), die auch in der Natur zum Einsatz kommt, nicht so empfindlich auf Energiezufuhr reagiert wie die linksdrehende. So konnten wir mittels Ramanspektroskopie nachweisen, dass die D-RNA UV-Licht besser absorbieren kann und insgesamt etwas stabiler ist [6]. Auch unsere Röntgenstrukturanalysen zweier chiraler RNA-Moleküle zeigen teils überraschende Unterschiede. Die Unterschiede betreffen nicht nur die Kristallmorphologie und die Kristallisationsbedingungen, sondern auch die intern gebundenen Wassermoleküle (Abb. 6). Die Bindung von Wassermolekülen und Ionen ist für die Struktur und Stabilität der Ribonukleinsäuren von besonderer Bedeutung. Jedes RNA-Molekül wird über Wasserstoffbrücken mit umgebenden Wassermolekülen stabilisiert und unsere Ergebnisse zeigen, dass dieses „Netzwerk aus Lösungsmittelmolekülen“ für zwei chirale RNA-Moleküle nicht identisch ist [7, 8, 9]. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Ribonukleinsäuren in der Evolution in großer Vielfalt entwickelt wurden und dass gerade ihre regulatorischen Eigenschaften für alle Lebewesen von entscheidender Bedeutung sind. Es sind diese regulatorischen Eigenschaften, die für den Einsatz in der zukünftigen molekularen Medizin von großer Bedeutung sein werden, sodass die Erforschung der RNA-Strukturen und somit das Verständnis der atomaren Funktionen dieser Moleküle mit höchster Priorität vorangetrieben werden müssen.

erdmann@chemie.fu-berlin.de

Literatur

[1] Shi,H. and Moore,P.B. (2000). The crystal structure of yeast phenylalanine tRNA at 1.93 A resolution: a classic structure revisited. RNA. 6, 1091-1105.
[2] Eichert,A., Furste,J.P., Schreiber,A., Perbandt,M., Betzel,C., Erdmann,V.A. and Forster,C. (2009). The 1.2A crystal structure of an E. coli tRNASer)acceptor stem microhelix reveals two magnesium binding sites. Biochem. Biophys. Res. Commun. 386, 368-373.
[3] Forster,C., Brauer,A.B., Perbandt,M., Lehmann,D., Furste,J.P., Betzel,C. and Erdmann,V.A. (2007). Crystal structure of an Escherichia coli tRNA(Gly) microhelix at 2.0 A resolution. Biochem. Biophys. Res. Commun. 363, 621-625.
[4] Petersen,M. and Wengel,J. (2003). LNA: a versatile tool for therapeutics and genomics. Trends Biotechnol. 21, 74-81.
[5] Eichert,A., Behling,K., Betzel,C., Erdmann,V.A., Furste, J.P. and Forster,C. (2010). The crystal structure of an ‚All Locked‘ nucleic acid duplex. Nucleic Acids Research 38, 6729-36
[6] Bolik,S., Rubhausen,M., Binder,S., Schulz,B., Perbandt, M., Genov,N., Erdmann,V., Klussmann,S. and Betzel,C. (2007). First experimental evidence for the preferential stabilization of the natural D- over the nonnatural Lconfiguration in nucleic acids. RNA. 13, 1877-1880.
[7] Perbandt,M., Vallazza,M., Lippmann,C., Betzel,C. And Erdmann,V.A. (2001). Structure of an RNA duplex with an unusual G.C pair in wobble-like conformation at 1.6 A resolution. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 57, 219-224.
[8] Rypniewski,W., Vallazza,M., Perbandt,M., Klussmann,S., Delucas,L.J., Betzel,C. and Erdmann,V.A. (2006). The first crystal structure of an RNA racemate. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 62, 659-664.
[9] Vallazza,M., Perbandt,M., Klussmann,S., Rypniewski,W., Einspahr,H.M., Erdmann,V.A. and Betzel,C. (2004). First look at RNA in L-configuration. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 1-7.