Chromatographie Systemtest

Single-Shot-Konzept zum Leistungs-Check von Chromatographiesystemen

von Dr. Joachim Emmert

Dr. Joachim Emmert, Universitätsmedizin Mannheim, Institut für Klinische Chemie

Bei Forderungen zur Qualitätskontrolle analytischer Verfahren und Geräte geht oftmals die Relation zwischen Kontrollen und Messergebnissen verloren. Dabei kann eine Hierarchie von Tests so angewendet werden, dass die zeitaufwändige OQ/PV- (OQ/PV = Operational Qualification/ Performance Validation) Prozedur nur einbis zweimal im Jahr und methodennahe Kontrollen innerhalb des jeweiligen Verfahrens durch QC- (Quality Control) Proben mit bekannter Konzentration des Analyten durchgeführt werden (1). Wenn auf einem Analysengerät verschiedene Verfahren laufen, kann ein Systemeignungstest (SST = System Suitability Test) Auskunft darüber geben, ob das Gerät noch die gewohnte Performance zeigt. Überprüft wird dabei dann z. B. die Stickstoffspezifität des NPFIDDetektors, die Halogenspezifität des ECD (beides GC), oder die Massenkalibration eines mit der HPLC oder GC gekoppelten Massenspektrometers.

Systemtests im zertifizierten Umfeld

Arbeiten im zertifizierten oder akkreditierten Umfeld erfordern eine Leistungsüberprüfung des verwendeten Gerätes. Dies kann arbeitstäglich, bei Verfahrenswechsel sowie nach Kalibration oder Umbau sein. Allerdings ist speziell bei einem LC/MS die Definition eines Umbaus schwierig, weil dieses sehr viele Einstellparameter besitzt. Für einen SST eignet sich am besten eine Substanz mit bestimmten Eigenschaften und in bestimmter Konzentration, welche die gewünschten spezifischen Messeigenschaften und ggf. deren Abweichung schnell aufdeckt. Das ist z. B. in der GC ein Gemisch aus je einer Stickstoff (N) und Phosphor (P) enthaltenden Substanz sowie einem Alkan (C) in unterschiedlichen Konzentrationen zur Messung der Spezifität des NPFID-Detektors, der im Umweltbereich eingesetzt wird. Bei der GC/MS müssen neben der chromatographischen Trennung und der generellen Detektion der Substanz Parameter wie Massengenauigkeit und Empfindlichkeit betrachtet werden. Hier hat sich Pentachlorphenol (PCP) als geeignet herausgestellt. Die 5 Chloratome im Molekül erzeugen im MS ein typisches Isotopenmuster (Abb. 1 unten). In höherer Verdünnung kann im SIM- (Selected Ion Monitoring) Modus eine quantitative Auswertung sowie eine Betrachtung der Peaksymmetrie vorgenommen werden (Abb. 1 oben). Erlaubte Abweichungen und Korrekturen ergeben sich aus einer Regelkarte (s. u. und Abb. 5) und der zugehörigen Verfahrensanweisung (SOP = Standard Operating Procedure).
HPLC-Anlagen werden meist turnusgemäß einer Leistungsfähigkeitsüberprüfung (OQ/PV) unterzogen. Dazu beginnt man zunächst mit einem Übersichtschromatogramm, es gibt Hinweise auf eventuelle Abweichungen. Dieses „Single Shot Chromatogram“ eignet sich auch für routinemäßige System checks. Das dazu verwendete Gemisch enthält vier Ketone (Aceton, Acetophenon, Propiophenon und Butyrophenon) unterschiedlicher Konzentration und wird isokratisch chromatographiert. Wenn der erste Peak bei 254 nm kleiner ist als der zweite (Abb. 2), ist wahrscheinlich die Wellenlängenkalibrierung des UV-Detektors falsch. Im vorliegenden Beispiel wurde so eine falsche Parameterzuordnung im Diodenarray- Detektor entdeckt. Nach Korrektur mit Erbiumperchloratlösung oder Holmiumoxidfilter stimmt die Wellenlängenkalibrierung wieder und das Chromatogramm entspricht der vorgesehenen Form (Abb. 2 unten).

LC/MS – ein komplexes Analysengerät

Ein LC/MS kann für viele verschiedene Aufgaben eingesetzt werden, z. B. für Proteomics oder Plasmaspiegelbestimmungen von Medikamenten. Eine besondere Herausforderung ist es, wenn das Gerät für beide Aufgaben eingesetzt wird und zusätzlich von HPLC auf Nano-LC umgebaut wird. Wegen des hohen Zeitaufwands kann das Gerät nicht jedes Mal qualifiziert werden, sondern nur im Abstand von einigen Wochen. Dann wird zuerst geprüft, ob die Einlasskapillare verschmutzt ist. Wenn Messungen im Negativ-Modus durchgeführt werden, muss das Gerät auch in diesem kalibriert werden. Die richtige Kalibration in allen Modi nachzuweisen, ist Teil des nachfolgenden SSTs. Hierzu wird zunächst eine verdünnte Lösung Reserpin eingespritzt und in den verschiedenen Auflösungen im Positiv-Modus in Bezug auf Massengenauigkeit gegen eigene Vorgaben geprüft, wobei natürlich die Spezifikation des Gerätes beachtet wird. Dann werden in einer Sequenz ein Blank, Reserpin und Digoxin mit einem Standard- Gradienten (Wasser- Acetonitril) chromatographiert. Ausgewertet werden EIC (= Extracted Ion Chromatogram) und Massenspektrum (Abb. 3 und 4).













Die Bedingungen sind durch das Ansäuern mit 0,1 % Ameisensäure für den Positiv-Modus optimiert. Man kann aber auch unter diesen Bedingungen Digoxin chromatographieren und im Negativ- Modus detektieren, da es besser geeignet ist als Reserpin. Dabei entsteht das [M+CHO2]– – Ion, das ist bei der Auswertung und Festlegung des EIC-Signals zu beachten. Fläche oder Höhe des EIC-Signals können in eine Regelkarte eingetragen werden. Für die Massengenauigkeit gelten erlaubte Abweichungen nach eigenen Vorgaben bzw. der Spezifikation des Gerätes im entsprechenden Messmodus. Forderungen nach wöchentlicher Kalibration oder Revalidierung nach jedem Umbau kommen vor, sind aber realitätsfern. Ein TOF- (Time of Flight) Massenspektrometer dagegen muss z. B. durch einen Lockmass-Kalibrator ständig (nach)kalibriert werden. Dieser Sonderfall soll aber in unseren Betrachtungen hier nicht weiter behandelt werden.

Die Regelkarte – ein Werkzeug zur Systemkontrolle

Messwerte gewinnen erst Aussagekraft durch Eintragen in eine Regelkarte, im vorliegenden Beispiel ist es eine Regelkarte zur Messung aromatischer Amine mittels GC/ MS (Abb. 5). Bei Einführung des Prüfverfahrens und der ersten Überprüfung von Kalibrationen und Prüfgerät mittels externem Standard wurden verschiedene Trendregeln nach Western Electric verletzt (2, 3). Folgende Maßnahmen wurden ergriffen:

Wert 04 Wiederholung der Prüfung
Wert 12 Weitere Beobachtung der Datenentwicklung zur Gewinnung von Erkenntnissen
Wert 53 Weitere Beobachtung der Datenentwicklung zur Gewinnung von Erkenntnissen
Wert 64 Auswertung der bisherigen Daten und Erstellung einer neuen Regelkarte unter Einbeziehung aller Daten

Eine Regelkarte entfaltet erst nach einer gewissen Zeit ihre Wirkung, während man eine falsche Wellenlängenoder Massenkalibration in der Regel sofort erkennt. Für beides gibt es geeignete Standards, teilweise sind diese kommerziell erhältlich. Dies hat den Vorteil einer unabhängigen Herstellung, großer Chargenkontinuität und garantierter Haltbarkeit. Bei Eigenherstellung wird gerade die Haltbarkeit meist unterschätzt. Die Wechselwirkungen zwischen Lösungsmittel, starker Verdünnung und Verpackungsmaterial (Glas, Kunststoff etc.) kann ebenfalls für Überraschungen sorgen. Für eine einwandfreie Kontrolle des Gerätes muss aber das Prüfmittel selbst möglichst fehlerfrei und rückführbar sein.

Fotos: © Dr. Joachim Emmert

Literatur
[1] M.P. Balogh, V.L. Corbin, LC/GC Europe 18, 78 (2005).
[2] ISO 8258, Shewhart Control Charts (1991).
[3] H. Petersen, M. de Mehr, Grundlagen der Statistik und der statistischen Versuchsplanung
Bd. 4, ecomed Verlagsgesellschaft mbH., Landsberg/Lech (1993).