Statt Viren: Synthetische Nanopartikel ermöglichen einen wichtigen Schritt in Richtung Primärzelltransfektion

Sterne für die biomedizinische Forschung

von Dr. Valérie Jérôme, Christopher Synatschke, Prof. Dr. Ruth Freitag, Prof. Dr. Axel H. E. Müller

„Öffnen sich die Schleusentore für die Gen-Therapie?“ So titelte kürzlich ein Editorial der Zeitschrift Nature Biotechnology. Denn mit Glybera wurde am 1. November 2012 von der Europäischen Kommission das erste Gentherapeutikum für die Anwendung im Menschen in der westlichen Welt zugelassen. Das Medikament kann Patienten helfen, die aufgrund einer fehlenden Lipoproteinlipase (LPL) immer wieder unter potenziell lebensbedrohlichen Entzündungen der Bauchspeicheldrüse leiden.

Auch viele andere Erbkrankheiten beruhen darauf, dass wichtige Proteine nicht korrekt produziert werden, und auch hier sind Gentherapeutika bereits in der Entwicklung. Dabei werden fast immer Viren als Vektoren verwendet. Viren transportieren die benötigte Erbinformation effizient in die gewünschten Gewebe und lösen dort die Genexpression aus. Doch trotz ihrer Erfolge ist diese Form der Gentherapie keineswegs unproblematisch. Häufig kommt es zu einer Immunisierung des Patienten gegen den viralen Vektor, sodass eine zweite Gentherapie mit diesem Vektor nicht möglich ist. Umso mehr drängt sich die Frage auf: Gibt es zu den Viren möglicherweise eine Alternative?

Nano-Sterne: ein Durchbruch bei der nicht viralen Transfektion

Schon seit geraumer Zeit sind in der zellbiologischen Forschung auch nicht virale, synthetische Gentransporter (Transfektionsmittel) bekannt, meist kationische Lipide oder Polymere. Solche Moleküle zeigen kaum immunauslösende Wirkung und sind auch leichter in großen Mengen herzustellen. Für eine Anwendung in der Medizin sind sie dennoch bislang kaum geeignet. Sie sind um Größenordnungen weniger effizient als Viren und würden den Patienten z.B. unnötig mit DNA belasten. Viel wichtiger aber ist, dass die bislang beschriebenen nicht viralen Transfektionsmittel kaum fähig sind, die DNA in den Kern von ausdifferenzierten, sich nicht mehr teilenden Primärzellen zu transportieren. Man nimmt an, dass sie an der Kernmembran scheitern. Auch bei Blutzellen, beispielsweise bei T-Lymphozyten, versagen die meisten der bekannten nicht viralen Transfektionsmittel. Nicht wenige Wissenschaftler hatten deshalb schon die Hoffnung aufgegeben, dass sich mit nicht viralen Transfektionsmitteln nennenswerte Fortschritte bei der Therapie genetisch bedingter Krankheiten erzielen lassen. Doch seit Kurzem gibt es Lichtblicke, denn einer Forschungsgruppe an der Universität Bayreuth ist jetzt ein Durchbruch gelungen, der die bisherigen Einschränkungen bei der nicht viralen Transfektion relativiert. Bei ihren Untersuchungen zu den Mechanismen der nicht viralen Transfektion haben die Bayreuther Wissenschaftler neuartige Nanopartikel aus Poly(2-(dimethylamino)ethylmethacrylat) (PDMAEMA) verwendet, deren Synthese das Bayreuther Polymerchemie-Team um Prof. Axel Müller erst vor Kurzem etablieren konnte. Ihre Existenz verdanken diese Nanopartikel („Nano-Sterne“) einer dramatischen Entwicklung, die seit einigen Jahren in der Polymerchemie zu beobachten ist. Durch kontrollierte („lebende“) Polymerisationsverfahren lassen sich zunehmend komplexere polykationische Strukturen reproduzierbar herstellen; jüngstes Beispiel sind die Bayreuther Nano-Sterne, bei denen von einem zentralen Silsesquioxan (SiO1,5)-Kern mehr als ein Dutzend PDMAEMA-Arme in alle Raumrichtungen ausgehen. Schon gängige biotechnische Produktionszellen wie CHO-Zellen wurden durch die Nano-Sterne wesentlich besser transfiziert als durch das Standardtransfektionsmittel PEI (Polyethylenimin). Völlig überraschend waren dann die Ergebnisse mit C2C12-Myoblastenzellen. Diese Zellen stellen ab einer gewissen Zelldichte die Teilung ein. Durch den Wechsel des Kulturmediums lassen sie sich zudem in myotubuläre Zellen differenzieren. Während die Transfektionseffizienz von PEI bei den teilungsarretierten bzw. den differenzierten C2C12-Zellen wie erwartet sehr gering war (< 2 %), transfizierten die Nano-Sterne diese Zellen bei hoher Viabilität vergleichsweise gut. Bei primären, aus Blutspenden isolierten menschlichen T-Lymphozyten konnten die Nano-Sterne Transfektionseffizienzen von bis zu 50 % erzielen, während die Erfolgsraten von PEI bestenfalls im einstelligen Prozentbereich lagen.

Mechanismen der nicht viralen Transfektion mithilfe von Nano-Sternen

Was sind mögliche mechanistische Grundlagen für das Verhalten der Nano-Sterne? Hier kann derzeit bestenfalls spekuliert werden; allerdings sind selbst bei den konventionellen polykationischen Transfektionsmitteln noch längst nicht alle Details des Gentransfers geklärt. Der erste Schritt zu einer erfolgreichen Transfektion ist die Aufnahme der verkomplexierten DNA durch die Zellen. Man nimmt an, dass die positiv geladenen Komplexe hierbei durch die negativ geladene Zelloberfläche angezogen werden. Dabei kommt es zu Wechselwirkungen mit den Membranlipiden, die vermutlich auch die hohe Zelltoxizität vieler Polykationen erklären. Standardtests für Zytotoxizität (ISO 10993-5, L292 murine Fibroblasten) und Hämolyse ergaben, dass die Nano-Sterne deutlich weniger toxisch sind, als man von einem Polykation dieser Größe erwarten würde. Das spricht für Unterschiede in der Wechselwirkung mit der Zellmembran, die vermutlich durch die virusähnliche, kugelförmige Gestalt der Nano-Sterne und die dadurch bedingte geringe Kontaktfläche zu den Zellen bedingt sind. Interessant sind auch die Ergebnisse bei Jurkat-Zellen. Diese Zellen sind mit PEI nur schlecht zu transfizieren, wahrscheinlich, weil ihnen die notwendigen Rezeptoren auf der Zelloberfläche fehlen. Die Nano-Sterne erreichen bei diesen Zellen dennoch durchgehend Transfektionseffi-zienzen von > 50 %. Ein grundlegend anderer Wechselwirkungsmechanismus mit biologischen Membranen könnte dann auch dazu beitragen, dass die Nano-Sterne sogar ausdifferenzierte und sich nicht mehr teilende Zellen transfizieren. Es ist möglich, dass in ihrem Fall die intakte Kernmembran nicht dieselbe Barriere wie etwa für PEI darstellt.
Ein weiterer strukturbedingter Unterschied zwischen dem Verhalten der Nano- Sterne und PEI ist die Bindung und anschließende Freisetzung der DNA in der Zelle. Hier ist davon auszugehen, dass die Nano-Sterne die DNA weniger fest binden und damit in Kernnähe deutlich leichter frei geben als PEI. Kinetische Untersuchungen zeigen zudem, dass die Nano- Sterne die DNA auch schneller zum Kern transportieren. Unterschiede in der Stärke der Polyelektrolytwechselwirkung könnten auch hinter einem weiteren experimentellen Ergebnis stecken. Bei vielen polykationischen Transfektionsmitteln ist die Effizienz in Gegenwart von Blutserum deutlich herabgesetzt, was ein zusätzliches Problem für die In-vivo-Anwendung darstellt. Man nimmt an, dass die Serumproteine die Ladung der Komplexe abschirmen. Die Nano-Sterne zeigen dagegen auch in Gegenwart von 10 Vol % Serum im „Transfektionscocktail“ noch ein sehr überzeugendes Ergebnis.

Nano-Sterne: ein generell anwendbares Designprinzip?

Viele der interessanten Eigenschaften der Nano-Sterne lassen sich somit auf ihre Struktur zurückführen. Diese ist allerdings nicht auf die bislang diskutierten Sterne mit einem Silsesquioxan (SiO1,5)-Kern beschränkt. Analog lassen sich – ausgehend von superparamagnetischen Maghämit-Kernen – magnetische Nano-Sterne [6] oder sogar durch Mizellbildung aus geeigneten amphiphilen Block-Kopolymeren stabile sternförmige, aber nicht kovalent verknüpfte Assoziate erzeugen (Patent eingereicht). Im Experiment zeigten auch diese Strukturen die bereits beschriebenen überlegene Transfektionseigenschaften. Gleichzeitig eröffnen sie weiter gehende Möglichkeiten. Die Mizellen lassen sich z. B. mit hydrophoben Molekülen beladen, während die Magnet- Sterne durch Anlegen eines magnetischen Feldes gezielt in bestimmten Körperregionen angereichert werden könnten. Bereits gezeigt wurde die Abtrennung von transfizierten Zellen mittels eines Magnetfeldes.

RNA-Interferenztherapie

Neben der Gentherapie gibt es noch weitere Möglichkeiten, in das Geschehen im Inneren einer Zelle therapeutisch einzugreifen. In vielen Fällen geht es weniger darum, ein Gen zu aktivieren, als vielmehr ein „überaktives“ Gen herunter zu regulieren. Das ist über eine RNA-Interferenztherapie möglich. Bei diesem Verfahren wird eine zur mRNA des Gens komplementäre, doppelsträngige kurze RNA-Sequenz (siRNA) in die Zelle eingeschleust und verhindert dort die Expression des Gens. Auch für das Einbringen von siRNA in Zellen existieren bislang kaum effiziente Vehikel. Während durch PEI „eingebrachte“ siRNA dementsprechend dann auch keine statistisch signifikante Reduktion in der Expression des Oberflächenrezeptors CD4 in menschlichen T-Lymphozyten bewirken konnte, drehte sich bei Verwendung der Nano-Sterne das Verhältnis von T-Lymphozyten mit hoher (CD4high) bzw. geringer (CD4low) CD4-Expression innerhalb der betrachteten Population praktisch um, d.h. von ursprüng-lich 68 % CD4high und 34 % CD4low auf 30 % CD4high und 70 % CD4low nach der Behandlung.

Fazit

Die Gene bestimmen ganz entscheidend, was im Inneren einer Zelle geschieht. Um auf dieser Ebene therapeutisch eingreifen zu können, muss eine Vielzahl von Barrieren und Schutzmechanismen überwunden werden. Viren zeigen uns, dass komplexe molekulare Aggregate dies in sehr gezielter und variantenreicher Weise können. Synthetische Agenzien sind hiervon – insgesamt gesehen – noch weit entfernt. Doch die Bayreuther Nano-Sterne könnten dazu beitragen, die Entwicklung zukünftiger Therapeutika deutlich voranzubringen.

Literatur
[1] (2012) Nature Biotechnol. 30, 805. [2] Moran, N. (2012) Nature Biotechnol. 30, 807-809. [3] Pezzoli et al. (2012) J. Appl. Biomater. Function. Mater. 10, 82-91. [4] Schallon, A. et al. (2012) Biomacromol. 13, 3436-3473. [5] Schallon, A. et al. (2011) Langmuir, 27, 12042-12051. [6] Majewski, A.P. et al. (2012) Biomacromol. 13, 857-866.