bioconfident grade: Zytokine & Wachstumsfaktoren

von Dr. Wolfram Marx, Dr. Mario Mehmel

Dr. Wolfram Marx und Dr. Mario Mehmel, AppliChem GmbH, Darmstadt

Was bedeutet rekombinante Proteine im bioconfident grade? Üblicherweise werden Wachstumsfaktoren und Zytokine in Bakterien, Hefen oder anderen eukaryontischen Expressionssystemen (z.B. Insektenzellen, CHO-Zellen) produziert. Sowohl die Produktionsorganismen als auch die Kultivierungsreagenzien (Medienbestandteile, Medienzusätze) bergen die Gefahr von Kontaminationen durch Bakterien, Viren und BSE. Aber auch Bestandteile davon, wie endogen produzierte Enzyme und andere Proteine, können als Verunreinigung auftreten. Besonders der Endotoxingehalt von bakteriell produzierten Wachstumsfaktoren ist relativ schwer zu minimieren.

Das Expressionssystem

1.) Endosperm der Gerste: Der zelluläre Hintergrund

Der Wirtsorganismus Gerste besitzt mit dem Endosperm ein spezialisiertes Speichergewebe, mit einer guten Proteinexpressionsmaschinerie, mit typischer eukaryontischer Proteinfaltung und – da Speichergewebe – für Proteine stabilisierende Umgebungbedingungen für die Langzeitlagerung. Diese biochemische Umgebung kann trefflich als inert bezeichnet werden, denn sie ist endotoxinfrei, besitzt nur eine sehr niedrige Proteaseaktivität und einen niedrigen Gehalt an Sekundärmetaboliten, sowie einem einfachen Proteinprofil. All diese Faktoren erleichtern das „downstream processing“ erheblich.

2.) Die Expressionskassette

Die Expressionskassette erlaubt eine hohe, Lokus- und Zeit-spezifische, stabile Expression des klonierten, rekombinanten Genes. Das Konstrukt ist für die Klonierung kleiner und großer Gene im Hochdurchsatzverfahren geeignet.

3.) Die Kultivierungstechnik

Durch die Nutzung modernster Züchtungsmethoden wird eine optimale Ertragsrate erreicht. Die Gerste wird hydroponisch, auf vulkanischem Bimsstein kultiviert, auf einem automatisiertem Förderband, welches die sich entwickelnde Gerste durch verschiedene Kultivierungszonen befördert. Jede Kultivierungszone bietet der Pflanze, die für ihre Entwicklung optimale Nährstoff- und Wassermenge. Dies ermöglicht nicht nur eine genaue Kontrolle aller der Pflanze zugeführten Stoffe, sondern erlaubt auch eine Gerstenkulturzucht mit minimalsten Umwelteinflüssen und Randbedingungen auf das biologische System. Im Ergebnis erzielt man eine optimale Expression bei niedrigerer Gesamtkeimzahl und am Ende des Prozesses eine leichtere Validierung.

Abb. 1 Endotoxinbestimmung in Zytokinen bioconfident grade (bioconf.)im Vergleich zu einer anderen kommerziellen Quelle, gemessen durch Associates of Cape Cod Industries, Deacon Park, Knowsley, Liverpool, UK; Der Wettbewerber des IFN-γ gibt als Endotoxingehalt „Weniger als 1 EU/µg rekombinanten IFN- γ“ an. bioconfident grade – verlässlich biologisch sicher: Ein neu entwickeltes Expressionssystem für rekombinante Proteine aus tierischen Organismen bedient sich des pflanzlichen Gerstenkorns. Dabei werden als Expressionsplattform die Speicherzellen des Endosperms genutzt, dem Nährgewebe des pflanzlichen Samens, welche die rekombinanten Proteine in einer biochemisch inerten Umgebung ohne Endotoxine produzieren. Gerste ist von der FDA als sicher eingestuft worden (G.R.A.S. Generally Recognised As Safe).

4.) Genetisch gleichartige (isogenische) Linien für Saatgutbanken

Für die Herstellung einer doppelt-haploiden, isogenischen Linie wird eine Gersten-haploid Mikrosporen-Kulturtechnologie eingesetzt. Als Ergebnis erhält man eine Genom- weite Homozygotie, was die Saatgutbank- Validierug erleichtert und die Konformität des Rohmaterials für eine sicherere pharmazeutische Anwendung garantiert. Isogenische Linien sind genetisch identische Linien über das gesamte Genom gesehen. Dies erleichtert die Qualitätskontrolle in einer Pflanzen-basierten Produktion von Bioprodukten.

Die Qualitätstestung

Um zu demonstrieren, dass die in Pflanzen produzierten Zytokine und Wachstumsfaktoren in ihrer biologischen Aktivität zu den zur Zeit kommerziell erhältlichen Proteinen vergleichbar sind, werden alle bioconfident grade Faktoren der entsprechenden Qualitätstestung unterzogen. In den jeweiligen faktorspezifischen Bioaktivitätstests wie z.B. Zellproliferationsassays schneiden alle Produkte vergleichbar zu den in nicht biologisch- sicheren Expressionssystemen produzierten Faktoren ab – häufig sogar besser! Zudem weisen sie häufig in Zytotoxizitätstests eine bessere Verträglichkeit auf, als Faktoren aus anderen Produktionsverfahren!

frei von human- oder tierinfektiösen Agentien
niedrige pyrogene und entzündungsauslösende Aktivität
frei von anderen endogenen Säuger- Wachstumsfaktoren
vergleichbar in eukaryontischer Glykosylierung
vollständige, natürliche Faltung durch eukaryontische Quelle
frei von tierischen Produkten
Serum-frei
Endotoxin-frei
Antibiotika-frei
Niedrige proteolytische Aktivität

Mit diesen Eigenschaften sind die bioconfident grade Wachstumsfaktoren und Zytokine theoretisch für den Einsatz in kosmetischen oder pharmazeutischen Anwendungen und für die Kultivierung von Stammzellen prädestiniert.

Generelle Anmerkungen zu den bioconfident grade Zytokinen und Wachstumsfaktoren

Lagerung und Rekonstitution

Die rekombinanten Faktoren werden lyophilisiert geliefert. Typischerweise werden die Proteine in PBS pH 7,2 gelöst, durch 0,2 ?m Filter sterilfiltriert und lyophilisiert. Um Verluste zu vermeiden, bitte das Produkt vor dem Öffnen kurz abzentrifugieren. In der Regel wird empfohlen, das lyophilisierte Protein in sterilem Wasser in einer Konzentration nicht niedriger als 100 ?g/ml zu rekonstituieren. Für die Langzeitlagerung empfehlen wir die Zugabe eines „carrier“ Proteins (0,1 % humanes oder Rinderserumalbumins; HSA oder BSA). Die lyophilisierten Proteine sind mehrere Wochen bei Umgebungstemperatur stabil, werden aber trotzdem bei -20° C gelagert (Langzeitlagerung). Wenn das Protein rekonstituiert wurde, sollte es entweder sofort eingesetzt werden, oder in Aliquots geeigneter Größe bei -20° C eingefroren werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen ist zu vermeiden.

Endotoxin-Gehalt

Die bioconfident grade Zytokine und Wachstumsfaktoren weisen in der Regel einen Endotoxin-Gehalt unter 0,005 ng pro µg Produkt (0,05 EU/µg) auf, was durch einen turbidimetrisch-kinetischen Assay ermittelt wird.

MAT Assay

Zusätzlich zu der oben erwähnten Endotoxin- Bestimmung, wird mit den gereinigten bioconfident grade Zytokinen und Wachstumsfaktoren ein Monozyten-Aktivierung- Test (MAT) durchgeführt. Er dient dem Nachweis pyrogener oder entzündungsauslösender Kontaminationen. Es wird hierfür der humane 10-plex Zytokin-Assay eingesetzt, der die IL-6, TNF-α ?und IL-1β ?Induktion bestimmt.

Protease-Aktivität

Die bioconfident grade Zytokine und Wachstumsfaktoren werden im Endosperm- Gewebe des Gerstenkorns (Hordeum vulgare) exprimiert. Dieses besitzt bis zu 50-mal weniger Protease-Aktivität als E. coli oder Säugerzellen.