Neue Verfahren für die Ligninmodifikation am Beispiel der Natur

Wohin mit dem Lignin?

von Dr.-Ing. Susanne Zibek, PD Dr. Steffen Rupp, Prof. Dr. Thomas Hirth, Dominik Rais

Der Holzbestandteil Lignin ist das zweithäufigste Biopolymer auf der Erde. Es wurde lange Zeit kaum stofflich genutzt und als Abfallstoff der Papier-
­­her­stellung größtenteils verbrannt. Dabei stellt Lignin die größte natürliche Quelle für Aromaten dar und kann bei der Herstellung verschiedener Kunststoffe ­fossile Rohstoffe ersetzen. Eine wichtige Voraussetzung für eine stoffliche ­Nutzung ist der Abbau zu kleineren Bruchstücken und deren gezielte ­Modifikation zu definierten Synthesebausteinen. Lignin ist im Gegensatz zu ­anderen Biopolymeren sehr komplex aufgebaut und chemisch außerordentlich stabil, was die Umsetzung zu definierten Abbauprodukten durch chemische oder physikalische Prozesse erschwert.

Ein Blick in die Natur zeigt, dass einige Pilze und Bakterien über die Fähigkeit verfügen, Lignin abzubauen und zu verstoffwechseln. Das Verständnis dieser natürlichen Mechanismen könnte helfen, neue Prozesse zur maßgeschneiderten Modifikation von Lignin zu entwickeln und bisherige Verfahren durch biotechnologische Verfahren zu ergänzen.

Lignin – zweithäufigstes Biopolymer der Welt

Verholzte Biomasse besteht zum Großteil aus dem Verbundstoff Lignozellulose. Dieser setzt sich aus den Komponenten Zellulose, Hemizellu­lose und Lignin zusammen. Zellulose ist ein unverzweigtes Polymer aus Glukosemonomeren, das vor allem in kristalliner Form aufritt und in Fasern, so genannten Fibrillen, angeordnet ist. Hemizellulose dagegen besteht aus verschiedenen Fünffach- und Sechsfachzuckern, die ein verzweigtes Polymer bilden, das die Zellulose­fibrillen umgibt. Bei der Verholzung von Pflanzen werden die aromatischen Ligninbausteine Coniferyl- Cumaryl- und Sinapylalkohol unter­einander radikalisch zu dem dreidimensionalen Polymer Lignin verknüpft, das sich an die Hemizellulosematrix anlagert [1] (Abb.1). Diese Struktur sorgt zum einen für die nötige Stabilität und Beständigkeit, die höheren Pflanzen das Höhenwachstum und den Transport von Wasser in Leitsystemen erlaubt, zum anderen stellt sie einen Schutz vor enzymatischen und mechanischen Angriffen durch Fraßfeinde dar [2, 3]. Hemizellulose und Zellulose können von vielen Organismen durch enzymatische Hydrolyse der glykosidischen Bindungen zu ihren Zuckermono­meren abgebaut und verwertet werden. Lignin ist, bedingt durch die ungerichtete radikalische Verknüpfung der Aromaten, ein sehr komplexes dreidimensionales Molekül mit chemisch resis­tenten und stereochemisch diversen Ether- und C-C-Bindungen [4]. Der Abbau von Lignin stellt daher eine große Herausforderung dar, dem nur wenige Organismen gewachsen sind.

Ligninabbau durch Pilze und Bakterien

Die Entwicklung des Ligninabbaus konnte auf das späte Karbonzeitalter datiert werden und wird mit dem starken Rückgang der Kohleab­lagerung in Zusammenhang gebracht [5]. Ins­besondere Weißfäulepilze sind dafür bekannt, Lignin effektiv abbauen zu können. Sie sekre­tieren einen Cocktail an Enzymen, die das Lignin­molekül im Zusammenspiel depolymerisieren. Auschlaggebend sind hierbei Oxidoreduktasen, die das Ligninmolekül über radikalische Reak­tionen angreifen. Die Ligninperoxidasen haben ein hohes Redoxpotential und oxidieren pheno­lische und nichtphenolische Ligninkomponenten. Mangan-Peroxidasen oxidieren Mn(II) zu Mn(III), das wiederum in das Ligninmolekül diffundiert und phenolische Strukturen oxidiert. Des Weiteren verfügen einige Weißfäulepilze über Versatile-Peroxidasen, die sowohl Mn(II) und als auch direkt nicht-phenolische Aromate oxidieren. Weiterhin spielen Laccasen beim Abbau von Lignin eine Rolle. Diese kupferhaltigen Oxidasen benötigen im Gegensatz zu den genannten Peroxidasen nur O₂ als Elektronenakzeptor. Jedoch können Laccasen nicht-pheno­lische Strukturen nur über Mediatormoleküle oxidieren [6]. Kürzlich wurde eine weitere Klasse von Peroxidasen, die so genannten Dyp-type-Peroxidasen, beschrieben, die wahrscheinlich ebenfalls am Ligninabbau beteiligt sind. Die Dyp-type-Peroxidasen kommen in Pilzen vor, sind jedoch im Gegensatz zu den anderen lignino­lytischen Peroxidasen auch in Bakterien zu finden [7]. Neben den Weißfäulepilzen sind einige Bakterienstämme innerhalb der Aktinobakterien und der alpha-und gamma-Proteobakterien beschrieben, die Lignin abbauen können [8]. Die Dyp-type-Peroxidasen könnten ähnlich wie bei den Pilzen auch beim bakteriellen Ligninabbau eine Rolle spielen. Ein weiterer Gegenstand der Erforschung des Ligninstoffkreislaufs ist die Minera­lisierung von Ligninabbauprodukten. Es sind einige Bakterienstämme bekannt, die Ligninabbauprodukte als Kohlenstoffquelle nutzen können. Diese Bakterien scheinen über eine Vielzahl von Enzymen zu verfügen, die in der Zelle niedermolekulare Ligninderivate weiter abbauen. Über Reaktionen wie die Demethylierung, Ringöffnung in Aromaten und Spaltung von Etherbindungen werden verschiedene Ligninderivate modifiziert, gespalten und letztlich als Pyruvat und Oxalacetat dem Zellstoffwechsel zugeführt [9]. Die Enzyme sind bisher nur zu einem geringen Anteil charakterisiert und viele Enzyme noch nicht identifiziert.

Warum den Ligninabbau erforschen?

Fossile Rohstoffe müssen langfristig nicht nur als Energieträger, sondern auch im Bereich der stofflichen Nutzung ersetzt werden. Das Konzept der Lignozellulose-Bioraffinerie umfasst den Auf­schluss und die ganzheitliche stoffliche Nutzung des erneuerbaren Rohstoffes Lignozelluose. Die Zucker aus der Hemizellulose und Zellulose können zur chemischen und biotechnologischen Herstellung verschiedenster Chemikalien eingesetzt werden. Lignin wird bereits in einigen Anwendungen eingesetzt, z.B. als Betonadditiv. Lignin bietet jedoch viele weitere Möglichkeiten wie beispielsweise die Herstellung verschiedenster Kunststoffe auf Aromatenbasis oder die direkte Umsetzung zu aromatischen Chemika­lien wie z.B. Phenol. In dem von BMEL und der FNR geförderten Verbundvorhaben „Lignoplast“ (Funktionalisierte Ligninspaltprodukte als Synthesebausteine für die Herstellung von Klebstoffen, Lacken, Polyurethanen und Epoxyden, FKZ:22024512) wird gemeinsam mit Industriepartnern der Einsatz von Lignin als Komponente in Polyurethanen und Kunstharzen untersucht. Dafür muss das Ligninmolekül zu kleineren funktionellen Bruchstücken abgebaut werden. Durch physikalische und chemische Prozesse lassen sich beispielsweise ß-Etherbindungen im Lignin leicht spalten, die C-C-Bindungen sowie Methoxylgruppen sind jedoch deutlich stabiler [3]. Biokatalysatoren könnten hier zur weiteren Modifizierung und Funktionalisierung von Lig­ninderivaten eingesetzt werden. Peroxidasen oxidieren aromatische Strukturen, wobei die Spaltung von C-C-Bindungen und die Entstehung neuer funktioneller Gruppen auftritt [1]. Des Weiteren können über spezifischere Enzyme wie beispielsweise Demethylasen neue funk­tionelle Gruppen erzeugt werden, die als Anknüpfungspunkt für Polymerisationsreaktionen dienen. Somit können gezielt die gewünschten Struktureigenschaften von Ligninabbauproduk­ten geschaffen werden. Verfahren mit neuen Bio­katalysatoren können an chemische und physikalische Prozesse anknüpfen und zu einer Erweiterung des Produktspektrums für Lignin als Rohstoff beitragen.

Entdeckung neuer ­ligninmodifizierender Enzyme

Neben der Kultivierung von Weißfäulepilzen und der Optimierung der Ausbeute von lignin­olytischen Enzymen werden am Fraunhofer IGB auch neue Enzyme zur Ligninmodifizierung gesucht. Dabei werden vor allem ligninolytische Bakterien betrachtet, da bakterielle Enzyme im Vergleich zu pilzlichen Enzymen einfacher in etablierten Wirtsorganismen wie E. coli hergestellt werden können. Da der bakterielle Lignin­abbaumechanismus und die daran beteiligten Enzyme nur wenig erforscht sind, bieten sie ein großes Potenzial für die Entdeckung und Untersuchung neuer ligninmodifizierender Enzyme. Eine Vielzahl verschiedener ligninolytischer Bakterienstämme wurde zunächst kultiviert und die oxidative Enzymaktivität im Überstand gemessen. Die beiden Stämme Pseudonocardia sp. und Streptomyces sp. wurden hinsichtlich ihres genetischen Hintergrundes näher untersucht. Die Genome wurden sequenziert, assemb­liert, die offenen Leserahmen identifiziert und in Aminosäuresequenzen übersetzt. Über einen Sequenzabgleich mit Datenbanken über BlastP wurden viele potenzielle Enzyme identifiziert, darunter drei Dyp-type-Peroxidasen und zahlreiche Enzyme des intrazellulären Aromatenstoffwechsels wie Demethylasen, Dioxygenasen und Hydroxylasen. Diese vorhergesagten Enzyme können Stoffwechselwegen zugeordnet werden. Beispielsweise wurden in Pseudonocardia sp. mehrere Enzyme des Protokate­chusäure-Abbauweges entdeckt (Abb.2). Die ­vorhergesagte Funktion der Vanillat-Monooxygenase stellt hier eine interessante Reaktion dar, da durch eine Demethylierung eine neue funktionelle Gruppe entsteht. Die neu identifizierten Enzyme werden in dem Wirtsstamm E. coli exprimiert, aufgereinigt und ihre katalytischen ­Eigen­schaften im Hinblick auf die Umsetzung von Lignin und Ligninderivaten untersucht. Es werden dadurch zum einen neue Erkenntnisse über den Vorgang des Ligninabbaus in Bakterien gewonnen und zum anderen sollen geeignete Enzyme zur Ligninmodifizierung gefunden und für industrielle Anwendungen bereitgestellt werden.

Literatur

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