OMI (organische Molekülidentifizierung) im Wasser mittels LC-MS(/MS): Schritte von „Unbekannt“ zu „Identifiziert“ – ein Diskussionsbeitrag

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von Dr. Thomas Letzel, Wolfgang Schulz, Thomas Lucke, Dr. Manfred Sengl, Dr. Marion Letzel

Die Analytik kleiner organischer Moleküle in Wasser ist aufgrund von Variabilitäten der Wassermatrix (Regen-, Grund- und Trinkwasser sowie Oberflächen- und Abwasser) und der Bandbreite an chemischen Strukturen in unterschiedlichsten Konzentrations­bereichen sehr anspruchsvoll. In der Ausgabe Labor & More 2013, 4, 30–35 stellten wir die in der Wasseranalytik genutzten Techniken „Target-, Suspected Target- und Non ­Target-Screening“ vor und beschrieben deren Einsatz inklusive der damit ­verbundenen Vor- und Nachteile. In diesem Artikel teilen wir diese Ergebnisse nun je nach Ansatz und Technik in verschiedene Kategorien ein und diskutieren sie ausführlich.

In der heutigen Zeit entwickeln sich analytische Nachweissysteme rasend schnell und werden dabei immer spezifischer und sensitiver. So könnte man meinen: Wasser auf darin gelöste Moleküle zu untersuchen sollte sehr einfach sein, besonders wenn man die Flüssigkeits­chromatografie (LC) in Kopplung mit der ­(Tandem-) Massenspektrometrie (MS(/MS)) nutzt [1,2 Abb.1]. Auch die große Zahl von LC-MS(/MS)-Geräten in wasseranalytischen Laboren lässt diesen Schluss zu.
Tatsächlich ist es auch sehr erfolgreich, diese Kopplung für die Quantifizierung bekannter kleiner organischer Moleküle im Wasser einzusetzen, denn wasserlösliche und gut ionisierbare Moleküle sind damit extrem gut zu analysieren. Dies gilt besonders dann, wenn man die Moleküle vor der massenspektrometrischen ­Detektion chromatografisch voneinander trennen kann [3,4]. Hierfür kommen die klassische Umkehrphasen-Flüssigchromatografie (RPLC; für mittelpolare bis unpolare Moleküle) sowie in jüngerer Zeit die Hydrophile Interaktions-Flüssig­chromatografie (HILIC; für polare Moleküle) [5] zum Einsatz.
Durch die zunehmende Nutzung von akkuraten und hochauflösenden Massenspektro­metern (HRMS) ist auch die qualitative Analyse hinsichtlich des Vorliegens organischer Spurenstoffe möglich. Hierbei gilt es, die anfallende umfangreiche Datenmenge zu analysieren. Die Analytiker stehen dabei vor großen Herausforderungen. Diese liegen im zielgerichteten Umgang mit der Datenmenge und vor allem den resultierenden analytischen Ergebnissen. Die ursprüngliche Annahme, dass massenspektrometrische Ergebnisse alleine ausreichend seien, um die Moleküle eindeutig zu charakterisieren, war – nicht zuletzt wegen vieler isomerer Verbindungen – letztlich nicht haltbar [6]. Mittlerweile besteht Einvernehmen, dass ohne weiteres Hintergrundwissen derart komplexe Proben nicht mehr sinnvoll greif- bzw. auswertbar sind [2 Abb.?2]. Somit kommt man nicht umhin, die erhaltenen Ergebnisse zu beurteilen und anschließend in Kategorien einzuteilen. Die Kategorisierung findet je nach Ebene der organischen Molekülidentifizierung (OMI) und der strategischen Ausrichtung statt. Die jeweilige Kategorie ergibt sich somit einerseits aus der genutzten Analytik, andererseits aber auch aus der Verwendung von Datenbanken und Referenzstandards.

Ausgangssituation der OMI-Kategorisierung

Die zunächst unterschiedlichen analytischen Techniken und strategischen Ansätze in der Wasseranalytik führten in den letzten Jahren ­immer mehr zu einer einheitlicheren Sichtweise. In der Wasserszene besteht Konsens in der Identifizierungsstrategie mittels instrumenteller Analytik wie auch der Nutzung von Datenbanken und Referenzsubstanzen zur vollständigen Identifikation von Spurenstoffen.
Kürzlich wurde durch J. Hollender und ­Mitarbeiter eine Klassifizierung von Messergebnissen veröffentlicht [7], die in die Levels 1 bis 5 (inkl. 2a/2b) aufgeteilt ist. Hintergrund der Einordnung ist überwiegend die Nutzung eines hochauflösenden, akkurat messenden Massenspektrometers. In die Auswertestrategie fließen auch weitere Informationen mit ein. Auf ein zusätzliches Studium dieses „Viewpoint“-Artikels sei hingewiesen, da in den folgenden Kapiteln aufbauend auf diesem diskutiert wird.
Die hier präsentierte komplementäre Kategorisierung stimmt mit der oben zitierten überein. Eine Erweiterung um den Vergleich von mehreren (hier von zwei) Laboren macht diesen Ansatz umfangreicher und verwendet ihn als weiter gehende Interpretationsgrundlage.

Grundlage der OMI-Kategorisierung mit mehreren eingebundenen ­Laboratorien

Organische Moleküle gelten im eigentlichen Sinne als identifiziert, wenn man diese zunächst unbekannten Substanzen soweit entschlüsselt hat, dass man eine Referenzsubstanz produ­zieren und sie mithilfe des synthetisierten Referenzmaterials anschließend physiko-chemisch bestätigen konnte. Ausgehend von dieser als Kategorie 1 gesetzten OMI ist die Kategorie 2 für Moleküle zu verwenden, die ohne eindeutige Referenzsubstanz entweder über analytische chemische Daten oder unter Zuhilfenahme von Stoffdatenbanken eindeutig zuordenbar sind (2a) oder aber durch so genannte „diagnostische Fragmente“ der benutzten Massenspektrometrie (2b) als bestätigt angesehen werden können. Sind beide Kriterien erfüllt, kann die Klassifizierung der OMI in der Kategorie 2 vorgenommen werden, bis sie durch Vergleich mit einer Referenzsubstanz auf Kategorie 1 angehoben wird. Die Kategorie 2 kann von einem einzelnen Labor (bzw. einem massenspektrometrischen System) erreicht werden. Sie kann aber auch aus kombinierten Informationen mehrerer Laboratorien (bzw. mehrerer massenspektrometrischer Systeme) erlangt werden. Die Kategorie 3 zur OMI gilt dann, wenn selbst unter Einbindung mehrerer Laboratorien (bzw. massenspektrometrischer Systeme) keine Festlegung einer eindeutigen Molekülstruktur möglich ist. Hier befindet man sich sozusagen in der „Grauzone“ der Identifizierung. Einige Indizien sprechen zwar für die OMI, allerdings sind diese Indizien nicht eindeutig genug. Die Einbindung mehrerer Laboratorien ermöglicht zwar die Er­härtung eines Verdachtsmoments, führt aber nicht zwingend zu eindeutigen Indizien. So kann ein MS/MS-Ergebnis mit der akkuraten Masse eines zweiten Massenspektrometers gekoppelt werden. Widerlegt das zweite System die Struktur nicht, z.B. durch eine andere Summenformel, so kann es der Kategorie 3 zugeordnet werden.

Die Kategorie 4 wird in zwei Unterklassen (4a und 4b) unterteilt. So wird eine Substanz, die z.?B. a) nur von einem Massenspektrometer (inkl. MS/MS-Messung) gemessen werden konnte oder b) von mehreren Labora­torien (akkurate Masse, aber ohne MS/MS-Ergebnisse) bestimmt werden konnte, definitionsgemäß in Kategorie 4 (a bzw. b) eingestuft. Somit kann unter Nutzung geeigneter weiterer Laboratorien (bzw. Technologien) die Kategorie 4 schnell überwunden und mindestens in Kategorie 3 aufge­wertet werden. In Kategorie 5 ordnet man so genannte „Massen von Interesse“ ein. Hier können auch (nicht) akkurate Massen von Molekülen einzelner Laboratorien enthalten sein.

Kategorisierung nach folgenden Stufen der organischen Molekülidenti­fizierung (OMI):

Kategorie 1: OMI durch Referenzsubstanz bestätigt

Kategorie 2: OMI durch mehrere eindeutige Indizien (ohne eferenzsubstanz) mit eventuell einschränkender Untereinteilung:
2a: OMI eindeutig bestätigt ausschließlich durch Datenbanken
2b: OMI eindeutig bestätigt ausschließlich durch „diagnostische Fragmente“ (aus Produktionenspektren)

Kategorie 3: OMI mit Ergebnissen aus mehreren Laboratorien (inkl. MS/MS und akkurater Masse), aber ohne eindeutige Indizien

Kategorie 4: OMI mit zunächst nicht zuordenbaren Ergebnissen aus
4a: aus einem einzelnen Labor (inkl. MS/MS)
4b: aus mehreren Laboren (ohne MS/MS) mit Summenformeln
Kategorie 5: OMI mit „Massen von Interesse“, die nicht zuordenbar sind

Strategische Vorgehensweise zur OMI-Kategorisierung

Was benötigt man nun für die Kategorisierung von analytischen ­Daten? ­
Welche Arbeitsschritte sind die Grundlage zur OMI?

Zunächst einmal legen wir die Analyse mittels LC-MS/MS fest. Für andere Trenn- bzw. Detektionstechniken gibt es ebenfalls Identifikationsstrategien mit entsprechend ähnlichen Varianten. In der hier erläuterten Strategie werden fünf Schritte im Arbeitsablauf festgelegt. Bis in welche Kategorie eine „Masse von Interesse“ im Laufe dieser fünf Schritte gehoben werden kann, hängt von den Ergebnissen innerhalb der einzelnen ­Arbeitsschritte ab. Die fünf Kategorien einer Identifizierung korrelieren dabei nicht mit den fünf durchzuführenden Arbeitsschritten (siehe Abb. 1).
Schritt 1 beinhaltet die grundsätzliche Datenbearbeitung wie „Feature“-Erkennung, Blind­wertberücksichtigung und grafische Wiedergabe. Eine Blindwertkorrektur ist als der wichtigste Schritt in dieser Stufe zu sehen, um falsch ­positive Befunde auszusortieren. Die ermittelten Features (Signal einer exakten Masse bei entsprechender Retentionszeit) können anschließend schon hier mit einer Datenbank abge­glichen werden, um erste Verdachtsverbindungen zu erhalten. Entfällt dieser Punkt, werden die Features ohne die Zuordnung von Verdachtsverbindungen weiter verarbeitet.
Schritt 2 beinhaltet die Plausibilitätsprüfung der aus Schritt 1 erhaltenen analytischen Daten unter Zuhilfenahme ihrer physiko-chemischen Eigenschaften. Features ohne die Zusatzinformation einer Verdachtsverbindung können hier unter Berücksichtigung der exakten Masse und des Isotopenmusters einer Summenformel zugeordnet werden.
Bei Schritt 3 werden nach festgelegten Parametern Features selektiert, die für die gesonderte Durchführung von Versuchen mittels ­Tandem-Massenspektrometrie (z.B. QTOF-MS) herangezogen werden. Hier ist die Wahl des Thresholds (d.h. die Mindesthöhe des ausgewählten Signals) ein wichtiger Parameter, um aussagekräftige und ausreichend intensive Produktionenspektren zu erhalten. In diesem Schritt entscheidet sich auch das erste Mal die OMI-Kategorisierung, da das MS/MS-Spektrum eine essenzielle Entscheidungshilfe zur Einordnung darstellt. Ist in nur einem beteiligten Labor eine MS/MS-Datenaufzeichnung möglich, kann nur noch eine Einstufung in Kategorie 4b erfolgen. In Kategorie 5 finden sich alle Komponenten, für die keine Fragment-Ionenspektren erhalten werden konnten.
In diesem Stadium ist es auch durchaus möglich, Daten aus Realproben qualitativ unter Verwendung eines Triple-Quadrupol-MS auf­zunehmen. Dazu werden, wenn die MS-Geräte vom selben Hersteller mit derselben Quellen­geometrie sind, die im Produkt-Ionenspektrum zur Identifikation aufgezeichneten Fragmentmassen in eine Triple-Quadrupol-Methode mit entsprechender LC-Methode übernommen. Damit ist es möglich, hochsensitiv und selektiv ­unbekannte Substanzen bereits vor der endgültigen Einstufung in eine Kategorie qualitativ mit geringem Aufwand in einer größeren Anzahl an Realproben zu bestimmen. Gleichzeitig ist damit eine erste Priorisierung nach Umweltre­levanz erreichbar.
Schritt 4 ist aktuell noch zeitintensiv und erfordert gegebenenfalls weitere Messungen, um aussagekräftige Ergebnisse nach der Interpre­tation der Messdaten zu erhalten. Die Ergebnisse aus diesem Schritt sind maßgeblich für die Identifikation einer Verbindung, da sie Grund­lagen sind für die Entscheidung, mit welcher Referenzsubstanz Schritt 5 durchgeführt werden muss. Zur Absicherung kommen meist Daten verschiedener Laboratorien zum Einsatz, was zusätzlichen Zeitaufwand und Abstimmungsbedarf bedeutet.
Ist Schritt 4 erfolgreich, so kann mit dem 5. Schritt eine eindeutige Zuordnung der zuvor unbekannten Substanz erfolgen. Hierfür muss eine bereits erhältliche oder im aufwändigeren Fall eine neu synthetisierte Referenzsubstanz vorliegen.

Einordnung der OMI-Kategorisierung

Der Zeitaufwand ist je nach Kategorie extrem unterschiedlich (siehe Abb. 2 oben). Die Spannweite reicht von wenigen Tagen bis zu mehreren Monaten für die vollständige Identifizierung (Kategorie 1) einer Verbindung. Die Beschaffung oder Synthese eines Referenzstandards zählt zu den zeit- und kostenintensivsten Schritten in dieser Strategie.
Gleichzeitig reduziert sich im Laufe der Auswertung einer Probe die Anzahl der zu bearbeitenden Komponenten vom ersten Schritt (Feature-Findung) bis hin zu einer möglichen Identifikation mittels Referenzsubstanz drastisch (siehe Abb.2 unten). Der Umfang der Komponentenreduktion ist stark abhängig von der Wahl der Parameter während der Plausibilitätsprüfungen (Schritt 2) und der Auswahl der ­Kandidaten für weiterführende Experimente wie die Aufnahme von Produkt-Ionenspektren. Wie weit ein Datensatz reduziert werden muss/kann, entscheidet sich nach der Anzahl der im „Feature-Finding“ erhaltenen Komponenten und ihrer Intensität. Es ist sicher sinnvoll, die intensivsten bzw. auffälligsten Komponenten für die weitere Bearbeitung auszuwählen. Erste Entscheidungshilfen sind dabei oft, die Treffer in Substanzlisten abzufragen und die damit verbundenen Metadaten zu nutzen, so z.B. Toxi­zitätsdaten, Abbauraten bei der Beurteilung technischer Prozesse oder spezifische Frage­stellungen aus dem Hintergrund der durchgeführten Untersuchungen. Eine solche prozessbezogene Fragestellung könnte z.B. das Auf­finden theoretisch ermittelter Transformations- oder Abbauprodukte bereits identifizierter Verbindungen während eines ausgewählten Prozesses sein.

Anwendung der OMI-Kategorisierung

am Beispiel von Carbamazepin und dessen Transformationprodukt Carbamazepin-10,11-epoxid
Als Grundlage für die Vorgehensweise bei der Datenbankabfrage und der weiteren Auswertung von Realproben dient eine LC-QTOF Screening-Messung mit positiver Elektrospray-Ionisation. Aus den MS-Scan-Daten werden mithilfe geeigneter Software Features extrahiert. Diese sind durch ihre exakte Masse und die ­Retentionszeit charakterisiert. Ein Abgleich der detektierten Features mit einer Stoffdatenbank wie beispielsweise STOFF-IDENT [8] oder DAOIS [9] über die exakte Masse ergibt hier im Beispiel einen Treffer für Carbamazepin.
Aus dem Datenbankeintrag des Carbama­zepins in DAIOS wird das eingetragene dazugehörende Transformationsprodukt (TP) Carbama­zepin-10,11-epoxid für eine Abfrage in den Roh­daten herangezogen. Vorhersagewerkzeuge wie das Predicted Pathway System der Univer­sity of Minnesota (UM-PPS) [10] bieten eine weitere Möglichkeit, Transformationsprodukte zu finden. Diese vorgeschlagenen Summenformeln und die daraus errechneten exakten Massen finden für die Abfrage in den Rohdaten Verwendung. Somit werden zusätzlich zu den Vorschlägen an bekannten Ausgangsverbindungen, die aus Datenbankabfragen stammen, ad hoc die möglichen Transformationsprodukte in die weitere Auswertung mit einbezogen. Die Identifi­kation der Ausgangsverbindungen und ihrer TPs erfolgt nun gemeinsam über dieselbe Auswertestrategie. Wenn die gesetzten Parameter für Plausibilität und Intensität erfüllt sind, erfolgen im nächsten Schritt die Aufnahme und die Interpretation von Produkt-Ionenspektren.
Die Ergebnisse der Tandem-Massenspektrometrie dienen als Grundlage zur Einstufung der Substanzen in die jeweiligen Kategorien. Bei Aufnahme der MS/MS-Spektren nur in die Realprobe und ohne Messung von MS/MS-Spektren einer Referenzsubstanz wäre durch die eingetragenen Fragmentmassen in DAIOS eine Einstufung beider Substanzen schon nach Kategorie 2 möglich. Erfolgt bei Vorhandensein der Referenzsubstanz eine Produkt-Ionenspektrenaufnahme in Probe und Standard und ist somit eine Bestätigung der Verbindung möglich, liegt das höchste Maß an Bestätigung vor (Kategorie 1 – siehe Abbildung 3)

Fazit

Eine OMI-Kategorisierung aus LC-MS(/MS) basierenden Daten von Wasserproben ist nach unterschiedlichen Gesichtspunkten möglich.
Eine kürzlich publizierte Sichtweise geht von einem Labor und dessen Ausstattung aus, d.h., sie richtet sich nach Massenspektrometer, Datenbanken und/oder Referenzsubstanzen.
Die in diesem Artikel ausgeführte Kategorisierung berücksichtigt zusätzlich auch die analytische Umgebung einzelner Laboratorien und nutzt die Vereinigung dieser „im besten Fall“ ergänzenden und komplementären Informationen. Dabei ist es natürlich von großer Bedeutung, dass die Laboratorien normierte Gemeinsamkeiten aufweisen, um Daten vergleichen zu können. So können Retentionszeiten auf unterschiedlichen Trennsäulen normiert werden oder aber TOF-MS Daten (neben der akkuraten ­Masse) durch QTOF-Daten validiert und bei Bedarf durch Tandem-MS Messungen (mit Struktur­information) erweitert werden. Die Übertragung dieser MS/MS-Daten ist erfahrungsgemäß ein gutes Werkzeug zur qualitativen Bestimmung von unbekannten Substanzen in Realproben mithilfe einer Triple-Quadrupol-Methode. Daten­banken und Referenzstandards lassen sich unter vernetzten Laboratorien sowohl real als auch generisch sehr einfach teilen und mit Neuem befüllen.
Unsere feste Überzeugung ist deshalb auch, dass die Zukunft von Screening-Techniken in der vernetzten Laborlandschaft umgesetzt wird. Dies führt letztlich dazu, dass in Routinelaboratorien billigere LC-MS-Systeme mit niedrigauf­lösender MS-Technologie Einzug finden werden und bei Bedarf durch hochauflösende und teurere MS-Systeme ergänzt werden. Des ­Weiteren wird die Erarbeitung einer gemeinsamen Datenbasis in diesem Bereich die Informationsdichte in bestehenden Stoffdatenbanken zunehmend erhöhen und somit einen noch ­professionelleren Einsatz dieser Datenbanken ermög­lichen. Wir freuen uns darauf!

Literatur
[1] Türk, J. (2012) Labor&More, 8, 46-49
[2] Letzel, T. (2013) Labor&More, 4, 30-35
[3] Menikarachchi, L. C. et al. (2012) Analytical Chemistry 84, 9388-9394
[4] Hug, A. et al. (2014) Environmental Pollution 184, 25-32
[5] Rajab, M. et al. (2013) Journal of Separation Science 36(18), 3011-3018
[6] Reemtsma, T. und Jekel, M. (2006) Organic Pollutants in the Water Cycle; Wiley-VCH
[7] Schymanski, E.L. et al. (2014) Environmental Science & Technology 48 (4) 2097–2098
[8] risk-ident.hswt.de/stoffident/app; zuletzt am 21.02.2014
[9] http://www.daios-online.de/daios/ ; zuletzt am 21.02.2014
[10] https://umbbd.ethz.ch/aboutBBD.html ; zuletzt am 21.02.2014

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