LC/MS/MS - Schnelle Analytik nichtsteroidaler Antirheumatika

Chromchat

von Dr. Dirk Hansen

Dr. Dirk Hansen, Phenomenex

Dank vieler Fortschritte in der Medizin und auch in der allgemeinen Versorgungslage in den letzten Jahrzehnten ist unsere durchschnittliche Lebenserwartung deutlich gestiegen. Eine längere Lebens erwartung hat viele Vorteile für den Einzelnen, allerdings auch einige Nachteile. Immer mehr Menschen leiden unter altersbedingten chronischen Krankheiten wie z.B. der rheumatoiden Arthritis, die mit starken Schmerzen einhergeht.

Die Behandlungen von chronischen Schmerzen erfolgen häufig mit nichtsteroidalen Antirheumatika (NSAR). Die oft eingesetzten Wirkstoffe Acetylsalicylsäure, Ibuprofen, Piroxicam und Diclofenac können bei Langzeitanwendung den Magen-Darm- Trakt schädigen und lebensbedrohliche Blutungen und Perforationen auslösen. Ein zusätzliches Risiko besteht in der Tatsache, dass diese Arzneimittel teilweise ohne ärztliche Verschreibung erhältlich sind und somit von vielen (älteren) Patienten ohne ärztliche Kontrolle zur Selbstmedikation eingesetzt werden. Als Alternative zu den NSAR können allerdings auch so genannte schwache Opiate, z.B. Tramadol und Codein, eingesetzt werden.

Abb. 1 Strukturformeln der analysierten Opiate.

Gerade bei geriatrischen Patienten wird häufig die Abhängigkeitsentwicklung geringer eingeschätzt als das gefährliche Nebenwirkungsrisiko der klassischen NSAR bei Langzeitanwendung. Starke Opiate wie z.B. Morphin werden vorzugsweise dann eingesetzt, um die Therapie bis zur Schmerzfreiheit einzuleiten. Wenn eine Schmerztherapie mit Morphin nur unter Inkaufnahme starker, nicht behandelbarer Nebenwirkungen möglich ist, dann kann auf andere Opiate gewechselt werden wie z.B. Hydromorphon und Fentanyl. Durch genaue Kontrolle der Wirkstoffkonzentration können bei den Opiatschmerzmitteln das Abhängigkeitsrisiko minimiert und der analgetische Effekt maximiert werden. Eine Methode, die Wirkstoffkonzentrationen zur ermitteln und die Dosierung anzupassen, ist die Analytik von Urinproben. Da die Zusammensetzung des Urins stark abhängig ist von der Ernährung, dem Flüssigkeitshaushalt und der Gesundheit, haben die endogenen Varianzen der Urin- Matrix einen großen Einfluss auf die chromatografische Analytik. Dieser Einfluss zeigt sich häufig in Form von Koelution und Ionensuppression (bei MS-Detektion). Dies kann zu falscher Quantifizierung und letztendlich falscher Dosierung führen. Um das zu vermeiden, wird eine Kombination aus Festphasenextraktion (SPE) und GC/ MS eingesetzt. Die Laufzeit für einen kompletten GC/MS-Lauf zur Analytik von Opiaten kann allerdings sieben Minuten oder länger sein.

Abb. 2 LC/MS/MS Chromatogramm einer Probe die mit allen untersuchten Opiaten einschließlich Standards versetzt war.

Im Folgenden wird eine neue LC/MS/ MS-Methode mit vorhergehender SPE-Aufreinigung vorgestellt. Mit dieser Methode konnten 13 häufig eingesetzte Opiate (Abb. 1) innerhalb von nur 1,5 Minuten auf einer Kinetex™ C18 2,6-µm-Säule (50 x 2,1 mm) bestimmt werden (Abb. 2). Das Einzigartige an der Kinetex™ Säule ist das kieselgelbasierte Sorbens, das in einem komplexen, von Phenomenex entwickelten Verfahren hergestellt wird. Dabei wird zuerst ein monodisperser, nicht poröser Kern (Ø 1,90 µm) erzeugt, auf dem im Anschluss eine homogene poröse Schicht mit definierter Schichtdicke (Ø 0,35 µm) wächst. Die engen Toleranzen bei der Herstellung des Basismaterials führen zu einer Partikelgrößenverteilung von 1,12. Dies führt dazu, dass Diffusionseffekte minimiert werden, was sich in einer sehr hohen Trenneffizienz auswirkt. Die erzielbaren Trenneffizienzen auf Standard-HPLCSystemen bei Drücken unterhalb 400 bar sind zwei- bis dreimal höher als die klassischer 3-µm- und 5-µm-Trennmaterialien. Dies erlaubt eine signifikante Verkürzung der Analysenzeit – abhängig von der Methode bis zu einem Faktor 20 und mehr. Sie sind damit vergleichbar mit vollporösen sub 2-µm-Materialien, die allerdings für diese Ergebnisse einen wesentlich höheren Rückdruck und speziell dafür ausgelegte UHPLC-Systeme benötigen.

Zur Freisetzung der Opiate aus ihren Glucuronid-Metaboliten wurden die Urinproben mit Β-Glucuronidase versetzt und für zwei Stunden bei 60°C inkubiert. Anschließend wurden die Proben zentrifugiert und die Überstände mithilfe eines polymerbasierten starken Ionenaustauschers gereinigt. Im Anschluss daran wurde die Probe mittels LC/MS/MS analysiert.

Durch die extreme Trenneffizienz der eingesetzten Kinetex Core-Shell-HPLC-Säule war es für unsere Zwecke nötig, für die einzelnen MRM-Übergänge Zeitfenster zu programmieren. Dies erlaubte es, die Scanrate ausreichend hoch für eine exakte Quantifizierung zu halten. Die außergewöhnlich geringe Peakbreite führte auch zu einer deutlichen Steigerung der Empfindlichkeit, was dazu führte, dass einige Proben um den Faktor 20 verdünnt werden konnten.

Die untere Quantifizierungsgrenze der Methode (LLOQ) lag bei 2,5 ng/mL mit einer Genauigkeit von 83–98 % für alle Substanzen mit Ausnahme von Fentanyl. Hier lag die untere Quantifizierungsgrenze bei 0,05 ng/mL, bedingt durch die niedrige therapeutische Konzentration. Für Morphin resultierte ein linearer Kalibrierbereich der von 2,5 bis 2500 ng/mL. Für Fentanyl lag der lineare Bereich zwischen 0,05 und 20 ng/mL.

Die vorliegende Methode erlaubt es, schnell und verlässlich die Wirkstoffkonzentrationen im Urin zu bestimmen und hilft somit, den Patienten individuell optimal einzustellen.

>> DirkH@phenomenex.com

Die vollständige Methodenbeschreibung (TN-1070) in englischer Sprache mit genauen Bedingungen und statistischen Daten ist von Phenomenex in elektronischer oder Papierform unter Anfrage@Phenomenex.com oder unter Tel. +49 (0)6021 588 300 zu erhalten.