LC/MS - pH stabile Umkehrphasen

Mixed-mode Phasen für die Probenvorbereitung in der Bioanalytik

Das Problem ist altbekannt: die unzureichende Langzeitstabilität von klassischen, kieselgelbasierenden Umkehrphasen, die nicht unter idealen Bedingungen betrieben werden. Nicht ideal heißt hierbei: pH-Werte außerhalb von pH 2.5 bis 7.5, hoher wässriger Anteil
in der mobilen Phase (< 20 % Organik) und Temperaturen um ca. 60–80 °C. Entscheidend für die Stabilität des Packungsmaterials ist demzufolge immer die Kombination aus pH-Wert, Temperatur und dem wässrigen Anteil in der mobilen Phase.

Dabei fragt sich der Anwender, warum bei der Optimierung der Trennung basischer Analyte auf die pHWert-Einstellung außerhalb des genannten pH-Bereichs – als zusätzliches Selektivitätstool – verzichtet werden soll. Die Säulenhersteller haben in den vergangenen
Jahren darauf reagiert und bieten immer zuverlässigere Säulen hinsichtlich Stabilität, Performance und Reproduzierbarkeit an – und es wurden auch pH-stabile Phasen entwickelt.

Worin liegt nun aber eigentlich das Problem?

Umkehrphasen auf Kieselgel sind zweifellos die Phasen mit der weitesten Verbreitung. Das liegt daran, dass Kieselgel ein annähernd ideales Trägermaterial ist. Mechanische Härte, enge Partikelgrößenverteilung, geeignete Porendurchmesser und beschleunigter Massenaustausch sind nur einige der wichtigen physikochemischen Parameter. Die Ur- sachen der mangelnden Langzeitstabilität von Kieselgel unter sauren Bedingungen liegen darin, dass eine sauer katalysierte Spaltung der Siloxanbindung zwischen der Kiesel-geloberfläche und dem Organosilan erfolgt und somit ein kontinuierlicher Verlust an stationärer Phase auftritt. Retention geht dadurch verloren. Hingegen führen pH-Werte über 8 zu einer Hydrolyse des Kieselgelgerüsts, vor allem dann, wenn die Säule bei höheren
Temperaturen betrieben wird. Die Auflösung des Packungsmaterials ist dabei auch von der Konzentration und Art der eingesetzten Puffer abhängig. Beobachtet wird ein mehr oder weniger schneller Verlust der Säuleneffizienz. Abhilfe sind einerseits die bessere Abschirmung durch ein geeignetes Oberflächenbonding, wie z. B. sterisch geschützte Silane, und andererseits ein gezieltes Endcapping, wodurch auch das Retentionsverhalten
von basischen Analyten verbessert wird. Tabelle 1 fasst einige der bekanntesten pH-stabilen
Phasen zusammen.

*Tabelle 1: pH-Stabile Phasen*
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Säule Hersteller pH-Bereich laut Hersteller
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XBridge WATERS Stresstest bei pH 10, 50 °C mit 50 mM TEA pH 1–12
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pHidelity RESTEK Stresstest bei pH 10, 50 mM TEA, 60 °C pH 12
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Gemini PHENOMENEX pH 1–12
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Eine Alternative zu anorganischen Trägermaterialien wie Kieselgel sind Polymerphasen auf Basis von PS-DVB, die pH-Werte von pH 1–13 tolerieren und keine Silanolgruppen
aufweisen, welche den Retentionsmechanismus – insbesondere von Basen – komplizieren. Allerdings ist ihre mechanische Stabilität nicht so hoch (Druckbegrenzung ca. 200 bar) und der Massentransfer ist im Vergleich zu Kieselgel-Phasen schlechter. Dennoch lohnt es sich, diese Phasen etwas genauer anzusehen, vor allem dann, wenn Langzeitstabilität gefragt ist und nicht die schnelle LC im Vordergrund steht (Produktübersicht POLYMER LABORATORIES, HAMILTON).
Weitere Möglichkeiten, interessante LC-Phasen mit erhöhter Temperatur- und pH-Stabilität zu verwenden, sind Trägermaterialien auf Basis von graphitiertem Kohlenstoff und Zirkoniumdioxid. Beispielsweise lassen sich poröse Phasen aus sphärischen
Kohlenstoffpartikeln sehr gut für die Retention von sehr polaren und ionischen Verbindungen sowie zur Trennung von strukturell ähnlichen Verbindungen wie Stereo- und Diastereomeren sowie Stellungsisomeren einsetzen. Die Oberfläche dieser Phase ist kristallin, besitzt
keine aktive Zentren und zeichnet sich durch besondere pH- und Temperaturstabilität aus (Hypercarb, THERMO ELECTRON).
Darüber hinaus stehen zirkoniumdioxidbasierende LC-Phasen zur Verfügung, die am ehesten mit Kieselgel zu vergleichen sind. Sie sind in verschiedenen Selektivitäten
(von RP- bis hin zu Anionenaustauschphasen) verfügbar und charakterisiert durch eine ausgezeichnete chemische Stabilität über den gesamten pH-Bereich von 0 bis 14. Zudem weisen sie eine hervorragende thermische Stabilität bis 200 °C auf, sodass sie ideale Phasen für die Hochtemperatur-LC sind. Die Oberfläche der Phase kann entweder positiv, neutral oder negativ geladen sein (Produktübersicht ZIRCHROM).
Ein zweites Thema, das angesprochen werden soll, ist der Einsatz von Mixed-Mode-Phasen in der Festphasen-Extraktion. Proteinfällungen reichen bei komplizierteren
Matrices und der Notwendigkeit, eine hohe Assay-Empfindlichkeit zu erreichen, oftmals nicht aus. Zudem ist bei der Proteinfällung häufig das Problem der Ionensuppression
durch Matrixkomponenten wie Proteine, Salze und Phospholipide gegeben. Daher wird sehr oft der Festphasen-Extraktion der Vorzug gegeben und selbst bei hohem Probendurchsatz stehen dafür geeignete 96 well-Platten mit den entsprechenden Mixed-Mode-Phasen
zur Verfügung.
Diese Mischphasen – seit Anfang der Neunziger Jahre erfolgreich in verschiedenen Konfigurationen eingesetzt – setzen sich in der Kieselgelform aus Mischungen
von C8- und dem entsprechenden starken Kationen- oder Anionenaustauscher zusammen. Es kann demzufolge nach zwei Retentionsmechanismen, nämlich Reversed-phase und Ionenaustauschmechanismus, gearbeitet werden. Saure, neutrale und basische
Analyte können durch entsprechende Wahl von Elutionslösemitteln fraktioniert konzentriert werden. Die Mixed-Mode-Phasen auf Kieselgelbasis haben – obwohl in zahlreichen forensischen und toxikologischen Protokollen etabliert – das Problem der eingeschränkten
Sorbenskapazität. So ist es nicht verwunderlich, dass mittlerweile zahlreiche polymere
Mischphasen und auch die jeweiligen schwachen Austauscher für stark ionische Analyten verfügbar sind. Es kommen identische Retentionsmechanismen zum Tragen, die pH-Stabilität ist ausgezeichnet und es fehlen basisch aktive Restsilanole, die bei kieselgelbasierenden Mischphasen manchmal zu schwierigen Elutionsbedingungen führten. Zudem weisen diese polymerbasierenden Phasen eine höhere Analytkapazität
auf. In der Zwischenzeit sind auch Kationenaustauschphasen auf dem Markt, die durch eine besondere Technologie der Oberflächenmodifikation die Ionensuppression verringern.
Übersicht über ausgewählte Mixed-Mode-Phasen Certify / Certify II Kieselgelbasierende stark saure VARIAN Kationen- und stark basische Anionenaustauscher
Plexa PCX Polymerbasierende Mixed-mode VARIAN Kationenaustauscherphase mit
Verringerung von Ionensuppressions-Effekten Strata XC/AW/CW Polymerbasierende Mischphasen.