Das p27-Protein ist mehr als eine Bremse des Zellzyklus

Zentrales Rollenspiel

von Prof. Dr. Ludger Hengst, Dr. Christoph Dohmesen

Prof. Dr. Ludger Hengst und Dr. Christoph Dohmesen, Sektion für Medizinische Biochemie, Biocenter – Medizinische Universität Innsbruck

Eine präzise Regulation ihrer Zellteilungen ist für Wachstum und Zell-Homöostase vielzelliger Organismen essenziell. Dabei wird genau gesteuert, wann und wie oft Zellen sich teilen dürfen. Vielfältige exogene und auch zellautonome Signale regeln die Teilungsfrequenz von Zellen und müssen dazu korrekt empfangen, prozessiert und integriert werden. Am Ende ihrer Signalwege steht die zentrale Maschinerie der Zellteilung, die entweder aktiviert oder inaktiviert wird. Motoren dieser Maschinerie sind Proteinkinasen, die Cyclin-abhängigen Kinasen (Cdks). Inhibitoren dieser Kinasen können als Bremsen wirken, indem sie Cdks inaktivieren und so Zellteilungen verhindern. Das Cdk-Inhibitor-Protein p27Kip1 spielt eine zentrale Rolle in der Regulation der Zellteilungen, indem es Ziel mitogener und antiproliferativer Signale ist, sie integriert und an die Zellzyklusmaschinerie weitergibt. Durch stöchiometrisches Binden reguliert p27 die Aktivität der Cdks. Netzwerke der Signalübertragung regulieren Expressionslevel, aber auch Funktion des Proteins, das nicht nur als Cdk-Inhibitor wirkt, sondern auch Funktionen in der Regulation von Zellmotilität und Apoptose wahrnimmt. Darüber hinaus kann es unter bestimmten Voraussetzungen sogar Cdks aktivieren und nicht als Tumorsuppressor, sondern als Onkoprotein fungieren. Phasen der Zellteilung

Eukaryotische Zellteilungen erfolgen in sequenzieller Abfolge diskreter Phasen, welche die Verdoppelung des Genoms und seine präzise Aufteilung in die Tochterzellen sicherstellen. Die DNA-Replikation findet während der S-Phase (DNASynthese) statt und die Aufteilung des Genoms erfolgt in der M-Phase (Mitose und Cytokinese) (Abb. 1).
Die beiden Phasen sind durch die „Gap“-Phasen (gap: Zwischenraum) G1 und G2 getrennt. Die Entscheidung für eine weitere Zellteilung wird normalerweise in einem definierten Zeitfenster in der G1-Phase getroffen. Bis zu einem Zeitpunkt in G1, dem Restriktionspunkt [1], ist eine Stimulation durch Mitogene oder Wachstumsfaktoren notwendig, um Zellen zur Teilung zu stimulieren. Bei deren Fehlen oder dem Überwiegen antiproliferativer Signale verlassen die Zellen den Zellzyklus in G1. Sie können die Teilungen transient (G0-Phase, Ruhephase) oder permanent (z.B. Seneszenz oder terminale Differenzierung) beenden. Ruhende Zellen können zur erneuten Proliferation stimuliert werden und dann in die G1-Phase zurückkehren. Der Übertritt des Restriktionspunktes macht Zellen unempfindlich gegenüber der Abwesenheit von Wachstumsfaktoren oder der Anwesenheit von Differenzierungssignalen [1], wodurch die Entscheidung für eine Zellteilung irreversibel wird.

Cyclin-abhängige Kinasen – die Motoren der Zellzyklusmaschinerie

Zentrale Übergänge im eukaryotischen Zellzyklus werden durch die oszillierende Aktivität von Cyclin-abhängigen Kinasen (Cyclin dependent kinases – Cdks) gesteuert. Diese Serin/Threonin-Proteinkinasen bestehen aus mindestens zwei Untereinheiten, der katalytischen Cdk- Untereinheit und der zur Aktivierung notwendigen Cyclin-Untereinheit. Zellzyklusregulatorische Cyclin/Cdk-Komplexe werden jeweils zu spezifischen Zeitpunkten des Zellzyklus aktiviert (Abb. 2) und ihre periodische Aktivierung, aber auch Inaktivierung ist für das Durchlaufen des Zellzyklus notwendig. Cdk-Inhibitoren – molekulare Bremsen der Zellproliferation Cyclin-abhängige Kinasen können von unterschiedlichen Mechanismen reguliert werden. Neben Cyclin-Bindung, Stabilität der Untereinheiten und Lokalisation des Komplexes regulieren auch inhibitorische und aktivierende Phosphorylierungen der Cdk-Untereinheit ihre katalytische Aktivität. Für die G0/G1/S-Übergänge und bei der Kontrolle des Restriktionspunkts spielt besonders die Regulation durch das Binden Cdk-inhibitorischer Proteine eine zentrale Rolle. Zwei Familien strukturell unterschiedlicher und funktionell andersartiger Cdk- Inhibitoren wurden in Säugetierzellen beschrieben, die Ink4- und die Cip/Kip- Proteine (siehe unten). Das vom CDKN1B-Gen codierte Cip/Kip-Protein p27Kip1 spielt eine zentrale Rolle in der Kontrolle des Restriktionspunktes [2]. Es dient dabei als zentrale Plattform zur Integration unterschiedlicher mitogener und antiproliferativer Signale, die über p27 auf die Zellzyklusmaschinerie wirken und die Entscheidung zwischen Proliferation und Ruhephase bestimmen. Dabei werden besonders Expressionslevel, Lokalisation und Funktion von p27 reguliert [2].

Abb. 2 Regulation des Zellzyklus durch Cdk/Cyclin-Komplexe und p27. Durch Binden von p27 können verschiedene Cdk/Cyclin-Komplexe inaktiviert werden. Phosphorylierung von p27 an Tyrosin Rest 88 ermöglicht der Kinase die ATP-Bindung. Dies schwächt die Inhibition der Cdk-Aktivität durch p27 signifikant.

Regulation der p27-Synthese

Obwohl auch die Transkription von CDKN1B reguliert werden kann, unterzliegen die zellzyklusabhängigen Veränderungen der p27-Menge vor allem posttranskriptionellen Kontrollmechanismen. Die Translation von p27 wird durch Sequenzen in der 5'-untranslatierten Region (5'-UTR) der mRNA reguliert. Diese Region enthält auch eine interne Initiationsstelle der Translation, eine Internal Ribosomal Entry Site (IRES). In nicht proliferierenden, ruhenden Zellen ermöglicht die IRES eine effiziente p27-Translation, auch wenn die generelle Protein-Biosynthese durch Inhibition der Cap-abhängigen Translation wenig effizient erfolgt [3]. Die Translation der CDKN1B-mRNA kann auch durch Micro-RNAs (miRNAs) inhibiert werden. Die miRNAs miR221 und miR222 binden an die 3'-UTR und können die p27-Translation hemmen [2].

Regulation der p27-Proteolyse

Die Stabilität von p27 verändert sich in der G1-Phase dramatisch. Während das Protein in der frühen G1-Phase relativ stabil ist, wird es bei Überschreiten des Restriktionspunkts unstabil (Abb.2) [2]. Der Abbau von p27 erfolgt durch das Ubiquitin-Proteasom-System. Dabei können unterschiedliche Ubiquitin-Ligasen p27 ubiquitinieren. Am G1/S-Übergang initiiert der SCFSkp2-Ubiquitin-Ligase-Komplex den Abbau von p27. Vorbedingung dazu ist allerdings, dass das Protein an Threonin 187 (T187) phosphoryliert wurde [2]. Paradoxerweise erfolgt diese Phosphorylierung durch aktive Cdk2, benötigt also eine aktive Kinase, die selbst effizient durch p27 gebunden und inhibiert wird. Daher war lange unklar, wie der Abbau von p27 beginnen kann, der dann durch einen Feedback-Loop Cdk2/Cyclin freisetzt. Diese aktive Kinase kann weiteres p27 phosphorylieren und so für den Abbau markieren (Abb.3).

Tyrosinphosphorylierung von p27 reguliert seine Stabilität und Aktivität

Ein Mechanismus zur Initiation des Abbaus von p27 am G1/S-Übergang kann durch eine initiale Phosphorylierung von p27 durch Tyrosinkinasen ausgelöst werden. Die Phosphorylierung von Tyrosin 88 (Y88) von p27 reduziert seine Fähigkeit zur Cdk-Inhibition und auch seine Stabilität [4, 5]. Verschiedene Tyrosinkinasen können diese Phosphorylierung ausführen, darunter Kinasen der Src-Familie [4,5] oder das Onkogen-Produkt BCR-Abl [5]. Die Phosphorylierung von Y88 in der Cdk-bindenden Domäne von p27 löst zwar nicht die Bindung an den Cdk-Komplex, induziert aber eine folgenschwere Strukturveränderung des gebundenen Inhibitors: Eine inhibitorische 310-Helix von p27 blockiert im unphosphorylierten Zustand die Purin-Bindestelle im aktiven Zentrum von Cdk2. Das verhindert ein Binden des Substrates ATP an die Kinase und inaktiviert diese. Durch Phosphorylierung des zentral in dieser 310-Helix befindlichen Tyrosin-Restes 88 (Y88) wird die gesamte 310-Helix aus dem aktiven Zentrum ausgeworfen (Abb.4). Dies führt zu einer teilweisen Aktivierung von an p27 gebundener Cdk2, die nun ATP binden und Substrate phosphorylieren kann (Abb.4). Zu den Substraten zählt interes santerweise der gebundene Inhibitor selbst, der jetzt im Komplex effizient an Threonin 187 phosphoryliert wird. Diese Phosphorylierung ermöglicht die Ubiquitinierung durch die Ubiquitin-Ligase SCFSkp2. Der ubiquitinierte Inhibitor wird vom Proteasom abgebaut, wodurch ein aktiver Cdk-Komplex freigesetzt wird (Abb. 3 und 4). Aktive, freie Cdk2-Komplexe können in Folge verstärkt p27 in anderen Cdk-Komplexen phosphorylieren und so einen positiven Feedback- Loop aufbauen, der zum effizienten Abbau von p27 führt (Abb. 3). Damit ändert sich die Stabilität von p27 dramatisch, sodass auch bei Auftreten antimitogener Signale p27 nicht akkumulieren kann, bis Cdks am Ende der Mitose inaktiviert werden. Somit kann in der Regel p27 erst wieder in der nächsten G1-Phase akkumulieren. Dieser Feedback-Loop trägt zur Unumkehrbarkeit des Restriktionspunktes bei. Die Abhängigkeit des p27-Abbaus von seiner Phosphorylierung durch aktive Cdks stellt ein attraktives Modell dar, in dem die SCF-Skp2-vermittelte p27-Proteolyse am Restriktionspunkt als Schalter wirkt, der eine schnelle, unumkehrbare Cdk-Aktivierung am G1/S-Übergang ermöglicht (Abb. 2, 3 und 4). Interessanterweise verringert die Phosphorylierung der p27 Tyrosine 88 und 89 seine Affinität für Cdk2 nur geringfügig [5], während die Affinität zu Cdk4-Komplexen zunimmt [6]. Im Gegensatz zu anderen Cdk/Cyclin-Paaren bindet Cyclin D nicht spontan an Cdks (Cdk4 und 6). p27 kann hier als molekulare Klammer die Komplexbildung ermöglichen und so Cdks sogar aktivieren. Phosphorylierungen von p27 an den Threoninen 157 und 198 durch Kinasen wie PKB/Akt erhöhen die Effizienz dieser Komplexassemblierung [7]. Ob diese Komplexe katalytisch inaktiv oder aktiv sind, hängt von der Phosphorylierung der Tyrosine 74 und 88 von p27 ab [5, 7].

Abb. 3 Feedback-Loop des Abbaus von p27 durch Cdk2-vermittelte Phosphorylierung am G1/S-Übergang. Die Ubiquitinierung durch die SCFSkp2-Ubiquitin-Ligase erfordert eine vorhergehende Phosphorylierung von p27 an Threonin-Rest 187. Freies aktives Cyclin/Cdk2 kann diesen Rest von p27 phosphorylieren und so den Abbau seines eigenen Inhibitors einleiten.

Abb. 4 Modell: Initiation des Abbaus von p27 durch Tyrosinphosphorylierung. Die Phosphorylierung von p27 an Tyrosin Rest 88 ermöglicht es der Cdk, ATP zu binden und den gebundenen Inhibitor an Threonin Rest 187 zu phosphorylieren. Dies kann die Ubiquitinierung und den proteasomalen Abbau des Inhibitors auslösen.

Cdk-unabhängige Aktivitäten von p27

Die Funktion von p27 beschränkt sich nicht nur auf die mechanistisch gut verstandene Regulation des Zellzyklus durch Cdk-Bindung. Eine weit gehend Cdk-unabhängige Aktivität von p27 stellt seine Rolle in der Zellmigration dar, einem Prozess, der auch für die Invasion und Metastasierung von Tumorzellen eine Rolle spielt. Besonders zytoplasmatisches p27 kann Cdk-unabhängig Zellmigration beeinflussen. In normalen, ruhenden Zellen befindet sich das meiste p27 im Zellkern. Über seine NLS (Nukleäre Lokalisations Sequenz) und NES (Nukleäre Export-Sequenz) pendelt p27 zwischen Zellkern und Zytoplasma. Phosphorylierung durch AKT/ PKB inaktiviert die NLS und trägt zudem über 14-3-3-Protein-Bindung zur zytoplasmatischen Lokalisation von p27 bei [2]. Je nach zellulärem Kontext kann eine Hemmung oder Stimulation der Zellmotilität durch p27 beobachtet werden. So inhibiert zytoplasmatisches p27 in Fibrosarkomzellen und normalen Fibroblasten die Migration durch Binden an das Protein Stathmin. Ebenfalls hemmt p27 den Übergang von der mesenchymalen zur amöboiden Zellbewegung in Fibroblasten. Dieser Prozess ermöglicht den Zellen sonst eine Migration auch durch kompakte Zellverbände [8]. Im Gegensatz dazu stimuliert zytoplasmatisches p27 in hepatozellulären Karzinomzellen die Zellmigration durch seinen Einfluss auf die GTPase Rac. Zudem inhibiert p27 RhoA, indem es seine Aktivierung durch GEF (GTP Exchange Factor) verhindert, was ebenfalls fördernd auf die Zellmigration wirkt (Übersicht: [2]).

Die Rolle von p27 in der Apoptose

p27kip1 spielt auch eine komplexe Rolle in der Apoptose. So wurde zum Beispiel gezeigt, dass die Spaltung von p27 und p21 durch Caspasen die Cdk2-Aktivität steigert, was wiederum das apoptotische Programm verstärkt [9]. Andererseits schützt p27 normales Gewebe vor einer exzessiven Apoptose in Rahmen einer Entzündungsreaktion [10]. In Leukämiezellen wurde gezeigt, dass die Überexpression von p27Kip1 die Apoptose inhibieren kann, indem es bereits die Freisetzung von Cytochrom C sowie die Aktivierung der Procaspase- 3 verhindert, was zur Resistenz gegenüber Chemotherapeutika führen kann [11]. Zudem kann LKB1/AMPK über p27 die Entscheidung zwischen Autophagie und Apoptose beeinflussen [12]. Vor Kurzem wurde eine Cdk-unabhängige proapoptotische Rolle von p27 identifiziert. So ist p27 für den von dem pharmakologischen Proteasominhibitor Argyrin A induzierten und Caspase-3 vermittelten Zelltod notwendig [13]. Die hierfür verantwortlichen Mechanismen sind allerdings noch ungeklärt.

p27-Exression als Tumormarker

Die p27-Expression ist ein Marker für die klinische Entwicklung humaner Tumore mit prognostischem und prädiktiv therapeutischem Potenzial. Niedrige (nukleäre) p27-Proteinmengen werden häufig in einem breiten Spektrum von malignen, humanen Tumoren wie z.B. Karzinomen der Brust, des Dickdarms oder der Prostata vorgefunden [2]. Die reduzierten p27 Level korrelieren mit einer gesteigerten Aggressivität der Tumorerkrankungen. Da Funktion, Lokalisation und Stabilität von p27 durch posttranslationale Modifikationen bestimmt werden und p27 durch Tyrosin-Phosphorylierung sogar von einem Tumorsuppressor zu einem Onkoprotein transformiert werden kann, erscheint es wichtig, in Zukunft Lokalisation und Modifikationen von p27 in die prognostischen und prädiktiven Analysen mit einzubeziehen. So könnte zum Beispiel die Tyrosin-Phosphorylierung von p27 mit einer Behandelbarkeit von bestimmten Tumoren durch Tyrosin-Kinase- Inhibitoren korrelieren und der therapeutische Erfolg durch Bestimmen der Y88-Phosphorylierung möglicherweise vorhergesagt und mit verfolgt werden.

CKIs: Inhibitoren Cyclin-abhängiger Kinasen

In Metazoen unterscheidet man aufgrund ihres evolutionären Ursprungs, ihrer Struktur, ihrer Wirkungsweise und ihrer Cdk-Spezifität zwei Familien von CKIs. Die Ink4-Proteine Vier Proteine bilden diese Familie von Proteinen, die sich durch Ankyrin- Repeat-Strukturen ausweisen. p16Ink4a, p15Ink4b, p18Ink4c und p19Ink4d binden Cdk4 sowie Cdk6 und können dadurch das Binden des Cyclins verhindern. Die vier Ink4-Proteine weisen eine Sequenzidentität von 40 % auf. Interessanterweise kodiert der Ink4a/Arf-Lokus ein weiteres Protein: ARF1 (Alternative Reading Frame 1), das ebenfalls als Tumorsuppressor agiert, indem es den p53-Antagonisten Mdm2 inhibiert.

Die Cip/Kip-Proteine Die Familie der Cip/Kip-Proteine besteht aus p21Cip1/Waf1/Sdi1 (kodiert von CDKN1A), p27Kip1 (CDKN1B) und p57Kip2 (CDKN1C). Den Proteinen ist eine aminoterminale Domäne von ca. 90 Aminosäuren gemeinsam, welche die Interaktion mit Cyclinen und Cdks vermittelt und sich in diskrete Cyclinund Cdk-Bindedomänen aufteilt, die durch eine Linker-Helix verbunden sind. Die Bindung der intrinsisch unstrukturierten Proteine (IUPs) beginnt durch Assoziation mit dem Cyclin und folgt dann einem Faltungdurch- Bindung-Mechanismus [16]. Cip/Kip- Proteine werden vornehmlich in der G0/ G1/S-Phase des Zellzyklus exprimiert und regulieren so die Aktivität von Cyclin D-, Eund A-Komplexen. Der C-Terminus der Proteine unterscheidet sich und ermöglicht es zum Beispiel, p21, PCNA zu binden und dadurch die Prozessivität der DNA-Replikation zu regulieren.

Struktur von p16Ink4a – gebunden an Cdk6 Die Abbildung zeigt die AS 10-134 von p16Ink4a (volle Länge: 156 AS) und AS 10-48 und 57-301 von Cdk6 (volle Länge: 326 AS). MMDB ID: 9460 nach [15]. Struktur von p27Kip1 – gebunden an CyclinA-Cdk2 Die Abbildung zeigt ein N-terminales p27Kip1-Fragment (AS: 25-93; volle Länge: 198 AS), welches die Cdk-inhibitorische Domäne enthält. Von Cyclin A ist ein Fragment von AS 175-432 (volle Länge: 423 AS) gezeigt und ein Cdk2-Fragment von AS 13 bis 298 (volle Länge: 298 AS). MMDB ID: 49840 nach [14].

p27 – Das Wichtigste in Kürze

- p27 wird in normalen und malignen Zellen durch vielfältige Signalübertragungswege
reguliert.

- Der proteasomale Abbau von p27 wird durch verschiedene Mechanismen und
Ubiquitin-Ligasen reguliert.

- Die mikro-RNA-vermittelte Inhibition der p27-Translation kann zur Reduktion von p27
in humanen Tumoren beitragen.

- Tyrosinphosphorylierung von p27 – unter anderem durch onkogene Kinasen wie
BCR-Abl oder Kinasen aus der Src-Familie – vermindert die Cdk2-Inhibition. Der Inhibitor
des Cyclin/Cdk2-Komplexes wird zum Substrat dieser Kinasen. Zudem transformiert
die Phosphorylierung den Inhibitor zu einem möglichen Aktivator Cyclin-abhängiger
Kinasen.

- p27 kann die Zellmotilität durch verschiedene Protein-Interaktionen beeinflussen.

- Die p27-Level sind in den häufigsten und tödlichen humanen, epithelialen Tumoren
reduziert, was mit einer schlechten Prognose assoziiert ist.

Literatur
[1] Pardee, A.B. (1974) Proc Natl Acad Sci USA 71, 1286-90
[2] Chu, I.M. et al. (2008) Nat Rev Cancer 8, 253-67
[3] Kullmann, M. et al. (2002) Genes Dev 16, 3087-99
[4] Chu, I. et al. (2007) Cell 128, 281-94
[5] Grimmler, M. et al. (2007) Cell 128, 269-80
[6] Kardinal, C. et al. (2006) Blood 107, 1133-40
[7] Larrea, M.D. et al. (2008) Mol Cell Biol 28, 6462-72
[8] Berton, S. et al. (2009) Mol Cell Biol 29, 5031-45
[9] Levkau, B. et al. (1998) Mol Cell 1, 553-63
[10] Ophascharoensuk, V. et al. (1998) Nat Med 4, 575-80
[11] Eymin, B. et al. (1999) Oncogene 18, 1411-8
[12] Liang, J. et al. (2007) Nat Cell Biol 9, 218-24
[13] Nickeleit, I. et al. (2008) Cancer Cell 14, 23-35
[14] Russo, A.A. et al. (1996) Nature 382, 325-31
[15] Russo, A.A. et al. (1998) Nature 395, 237-43
[16] Lacy, E.R. et al. (2004) Nat Struct Mol Biol 11, 358-64