UHPLC in der Bioanalytik

Keep it small & solid

von Judith Vajda, Regina Römling

UHPLC-Systeme werden immer häufiger in der Qualitätskontrolle klassischer pharmazeutischer Wirkstoffe – der so genannten „kleinen Moleküle“ – überwiegend in Kombination mit Reversed Phase-Chromatografie eingesetzt. Dieser Trend zeichnet sich inzwischen auch in der Bioanalytik ab. Hierbei muss jedoch abhängig von der Empfindlichkeit der Zielmoleküle gegenüber erhöhten Drücken und Reibungswärme sorgfältig geprüft werden, unter welchen Bedingungen die bestehenden Methoden auf schnellere UHPLC-Methoden umgestellt werden können.

Monoklonale Antikörper (mAb) sind wirksame Waffen gegen schwer wiegende Erkrankungen wie Krebs und Auto immunkrankheiten und gehören zu den Biotherapeutika mit den stärksten Wachstumsraten. Aktuell sind unter den Top Ten der Blockbuster 4 Antikörperpräparate vertreten und in den nächsten Jahren werden voraussichtlich die ersten Antikörper-Biosimilars eingeführt werden. Der vermehrte Einsatz, die Ausweitung der therapeutischen Anwendungsgebiete und Fortschritte in der Zellkulturentwicklung führen zu immer größeren Produktionsmaßstäben. Gerade die sehr leistungs fähigen Zellkulturen mit hohen Expressionsraten können stark von Aggregatbildung betroffen sein. Antikörper aggregate sind jedoch im therapeutischen Einsatz nicht zulässig, da sie zu unerwünschten Nebenwirkungen führen können. Zudem ist die therapeutische Wirkung der Aggregate schwierig zu beurteilen, wodurch eine passende Dosierung des Antikörper prä parats erschwert wird. Um die Produkt sicherheit zu gewährleisten, gehört neben der Überprüfung von Glykosylierungs mustern auch die Quantifizierung von Ladungs varianten und Aggregaten zu den Standardprozeduren der pharmazeutischen Qualitätskontrolle von Antikörperpräparaten.

Schnelle Bestimmung von Proteinaggregaten

Für die Aggregatbestimmung wird typischerweise die Größenausschlußchromatografie (size exclusion chromatography, SEC) eingesetzt, für die Analyse der Ladungsvarianten die Ionenaustauschchromatografie (IEC). SEC, eine vergleichsweise einfache Trennmethode, ist praktisch wechselwirkungsfrei und benötigt keine Anpassung der Methode an unterschiedliche Zielmoleküle wie die meisten interaktionsbasierten Verfahren. Gerade für die SEC wird diskutiert, in welchem Maße die hohen Drücke, die mit den in der UHPLC üblichen sub- 2 m Materialien verbunden sind, und die damit einhergehende Reibungswärme kritisch für die Integrität der Makromoleküle sind und sogar Artefakte (zusätzliche Proteinfragmente oder Aggregate) verur sachen können. Diese Risiken können einfach umgangen werden, indem die Partikelgröße weniger stark reduziert wird, jedoch die Säulendimensionen für die UHPLC- Anwendung optimiert werden. Eine neue Familie von kieselgelbasierten Säulen wurde speziell für die SEC-Analyse von Antikörpern entwickelt. Abbildung 1 zeigt die Analyse eines aggregierten monoklonalen Antikörpers auf TSKgel Super SW mAb HTP (4 m, 4.6 mm ID x 15 cm L). Im Vergleich zur Standardmethode auf einer TSKgel G3000SWXL SEC-Säule (5 m, 7.8 mm ID x 30 cm L) bleibt die Auflösung von Aggregaten und Monomer erhalten, lediglich die Auflösung zwischen Dimer und den hochmolekularen Aggregaten wird leicht beeinträchtigt. Die Analysenzeit wird jedoch von 16 min auf 4 min verkürzt, in denen auch die Elution etwaiger Fragmente detektiert werden kann. Dies wurde zum einen durch veränderte Säulendimensionen erreicht, zum anderen wurde die lineare Flussgeschwindigkeit im Vergleich zur Standardanalytik erhöht.
Wird die verwendete Säule in einer UHPLC- Anlage eingesetzt, profitiert die SECTrennung von dem geringen Totvolumen der modernen UHPLC-Systeme und erreicht die höchste Auflösung. Die 4 m großen Silikapartikel können jedoch auch in einer konventionellen HPLC-Anlage eingesetzt werden, da der in der Säule entstehende Druck 130 bar nicht übersteigt.

Analyse von Ladungsvarianten

Neben der isoelektrischen Fokussierung ist die Kationenaustausch-Chromatografie die Methode der Wahl zur Analyse der Ladungsheterogenität von Proteinen. Unterschiedlich geladene Proteinvarianten entstehen durch die Desamidierung von Asparaginoder Glutaminresten oder durch unvollständige Entfernung von Lysinresten am CTerminus. Ladungsvarianten rekombinanter Proteine können mittels Ionenaustauschchromatografie (IEC) auf TSKgel STAT- Säulen analysiert und quantifiziert werden. TSKgel STAT-Ionenaustauscher basieren auf unporösen Polymerpartikeln mit einem Netzwerk von funktionellen Gruppen an der Oberfläche: Im Falle des starken Kationenaustauschers SP-STAT sind dies Sulfopropyl- Gruppen. Abbildung 2 zeigt einen Vergleich der Analyse von Ladungsvarianten eines monoklonalen Antikörpers auf einer TSKgel SP-STAT-Säule auf einem konventionellen HPLC-System mit den Ergebnissen auf einer UHPLC-Anlage. Wie erwartet profitiert die Auflösung und Peakbreite der Ladungsvarianten von dem geringeren Totvolumen und optimierten Design des UHPLC Systems. Die Analysenzeit ist wegen der Verwendung gleicher Flussraten in der UHPLC nur unwesentlich verkürzt und wird mit beiden Systemen durch die Verwendung der nichtporösen Partikel deutlich unter die mit konventionellen HPLC-Säulen benötigte übliche Dauer von 30 – 45 Minuten reduziert. Je nach untersuchtem Antikörper kann die Trennung in 15 Minuten realisiert werden.

Zusammenfassung

Für die beiden hier beschriebenen biochromatografischen Methoden, Größenausschluss- und Ionenaustauschchromatografie, können die in der traditionellen HPLC bewährten stationären Phasen in optimierten Säulendimensionen ideal auch in UHPLC-Systemen verwendet werden. Dies vereinfacht den Methodentransfer und macht den Validierungsaufwand überschaubar. Der Durchsatz kann durch die kürzeren Analysenzeiten deutlich erhöht werden, bei gleich bleibend hoher Robustheit der Methoden. Diese Vorteile können nicht nur in der Qualitätskontrolle von Arzneimitteln ausgenutzt werden, sondern zum Beispiel auch während der Herstellung der Biopharmazeutika in der Kontrolle von Fermentations- oder Aufreinigungsprozessen.

Foto: © Judith Vajda / Regina Römling