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Neue Fluoreszenzproteine für anaerobe Systeme

FMN-bindende Fluoreszenzreporter

von Dr. Thomas Drepper, Prof. Dr. Karl-Erich Jaeger, Dr. Michael Puls

Fluoreszierende Proteine ermöglichen die direkte Visualisierung biologischer Prozesse in lebenden Organismen und sind so zu einem Standardwerkzeug der modernen Molekular- und Zellbiologie geworden. Aufgrund der sauerstoffabhängigen Chromophorsynthese sind Fluoreszenzproteine der GFP-Familie jedoch nicht universell einsetzbar und bleiben in O2-limitierten Systemen inaktiv. Um dennoch Licht in das Dunkel anaerober Organismen bringen zu können, wurden neue, FMN-bindende Fluoreszenzreporter entwickelt.

Fluoreszierende Proteine der GFP-Familie

Fluoreszierende Proteine, wie das aus der Qualle Aequorea victoria stammende grün fluoreszierende Protein GFP, sind in vielen Bereichen der Biowissenschaften zu einem unverzichtbaren molekularen Werkzeug geworden. Die genetisch -kodierten Reporterproteine können zur Erforschung komplexer biologischer Prozesse in lebenden Organismen wie der Expression, Lokalisation, Bewegung und Interaktion von Proteinen [1,2] eingesetzt werden. Dazu werden die Zielproteine mittels gentechnologischer Verfahren durch die Fusion mit einem Reporter-protein fluoreszenzmarkiert und somit sichtbar gemacht. Moderne bildgebende Verfahren, wie z.B. die Fluoreszenzmikroskopie, erlauben so die direkte Beobachtung solcher Abläufe in lebenden Zellen und Geweben. Für die „Entdeckung und Weiterentwicklung des grün fluoreszierenden Proteins“ wurde aus diesem Grund im Jahr 2008 der Nobelpreis für Chemie an Osamu Shimomura, Martin Chalfie und Roger Tsien verliehen.
Neben dem grün fluoreszierenden Protein sind mittlerweile zahlreiche GFP-ähnliche Fluoreszenzproteine identifiziert worden, die hauptsächlich aus verschiedenen Quallen (Hydrozoa und Siphonophora) und Korallen (Anthozoa) stammen und die in allen Farben des Regenbogens leuchten [3]. Alle Fluoreszenzproteine der GFP-Familie weisen eine helle intrinsische Fluoreszenz auf. Für die Lichtabsorption und Fluoreszenz ist immer ein im -Zentrum des Proteins lokalisiertes Chromophor verantwortlich, das durch eine auto-katalytische Zyklisierungsreaktion dreier Aminosäuren gebildet wird [4]. Da für die vollständige Synthese des Chromophors jedoch in jedem Fall molekularer Sauerstoff benötigt wird, weisen die Fluoreszenreporter der GFP Familie einen grundsätzlichen und entscheidenden Nachteil auf: Die Verwendung ist in vivo auf aerobe biologische Systeme beschränkt.

Alternative Fluoreszenz-reporter für anaerobe Systeme

Eine völlig neue Gruppe von fluoreszierenden Reporterproteinen, die im Gegensatz zu den Proteinen der GFP-Familie auch unter anaeroben Bedingungen leuchten, wurde kürzlich in unseren Laboren entwickelt [5,6]. Die neuen Fluoreszenzproteine sind rekombinante Varianten bakterieller Blaulicht-Rezeptoren der LOV (Light-Oxygen-Voltage)-Familie [7]. Anders als die GFP-ähnlichen Fluoreszenzproteine sind die neuen Fluoreszenzmarker sehr klein (16–19 kDa) und binden das vom Wirtsorganismus bereitgestellte Chromophor Flavin-Mononukleotid (FMN). Dieses Molekül wird sowohl in Pro- als auch in Eukaryonten sauerstoff-unabhängig synthetisiert. Um die FMN-abhängige Fluoreszenz der Blaulichtrezeptoren zu erhöhen und somit deren Verwendung als Fluoreszenzmarker zu ermöglichen, wurden die bakteriellen Proteine mittels moderner Verfahren, der so genannten directed evolution (siehe Infobox), verändert. Durch Mutationen wurde die Autofluoreszenz der Proteine drastisch erhöht, wodurch die FMN--bindenden Fluoreszenzproteine (FbFP, Aufmacherbild) entstanden. Die erzeugten FbFPs werden inzwischen von der Biotech Firma evocatal GmbH (Düsseldorf) unter dem Namen evoglow™ vertrieben. Die Fotochemische Charakterisierung der neuen Markerproteine ergab, dass die Fluoreszenz-Intensitäten und damit auch die Sensitivitäten der FbFPs mit denen der GFP-Familie annähernd vergleichbar sind.
Ähnliche Experimente wurden in verschiedenen Mikroorganismen durchgeführt, die anaerob, also unter sauerstoff-freien Bedingungen, leben können [5,8]. Auch hier konnte eindeutig die für FbFP charakteristische Fluoreszenz nachgewiesen werden, während Fluoreszenzpro-teine der GFP-Familie „dunkel“ blieben (Abb. unten rechts).
Neue Anwendungen für anaerob fluoreszierende Proteine
Damit ergibt sich eine ganze Reihe neuer Anwendungsmöglichkeiten: Anaerobe und fakultativ anaerobe Mikroorganismen spielen in vielen medizinischen und technischen Bereichen eine zentrale Rolle. Bestimmte pathogene Mikroorganismen können sich beispielsweise aufgrund -ihrer Fähigkeit, auch ohne Sauerstoff wachsen zu können, gezielt in sauerstoffarmen Bereichen des Körpers ansiedeln, wie z.B. in erkranktem oder geschwächtem Gewebe, kleineren Kavitäten oder schlicht im Zahnbelag. Auch im Inneren von medizinischen Geräten können sich solche Er-reger anhaften (Biofilmbildung) und mitunter Gefahrenquellen darstellen. Die Mechanismen der Besiedelung und die Stoffwechselvorgänge, die in diesen Organismen ablaufen, können mithilfe der -FbFP-Marker erstmals nichtinvasiv in vivo untersucht werden.
Solche Untersuchungen erfolgen auf zellulärer Ebene beispielsweise durch Konstruktion von transkriptionalen Genfusionen: Möchte man untersuchen, unter welchen Bedingungen und wie stark ein Gen exprimiert wird, koppelt man das Gen bzw. seinen Promotor mit einem Reporter-Gen, das für ein fluoreszierendes Protein codiert. Stellt man dann die entsprechenden Bedingungen ein, kann man anhand der Fluoreszenzintensität in der Zelle direkte Rückschlüsse auf das Expressionsniveau und den Zeitpunkt der Genexpression ziehen. In Proteinlokalisationsstudien kann durch Mikroskopieverfahren sogar nachgewiesen werden, an welcher Stelle das korrespondierende Protein in der Zelle lokalisiert ist. Bislang konnten solche Methoden nur in aeroben Organismen und Zellen mit Proteinen der GFP-Familie durchgeführt werden – erstmals ist dies nun auch unter hypoxischen Bedingungen möglich. Ein Werkzeug zur Untersuchung des fakultativ anaeroben Hefepilzes Candida albicans beispielsweise, der bei immundefizienten Patienten zu schweren Entzündungen führen kann, wurde kürzlich unter Verwendung von FbFP-Proteinen an der Universität Düsseldorf entwickelt [8].

Fluoreszenzmarker für technische Anwendungen

Auch in biotechnologischen Prozessen spielen anaerobe Organismen eine zentrale Rolle, beispielsweise in der Produktion von Biotreibstoffen wie Bioethanol und -butanol oder aber in Biogasanlagen. Auch in Abwasserreinigungsanlagen werden teils hochkomplexe Konsortien aus aeroben und anaeroben Mikroorganismen in Biofilmen kultiviert, deren Stoffwechsel äußerst komplex reguliert ist. Hier bieten die FbFP-Proteine ebenfalls neue Untersuchungsmöglichkeiten.
Ein weiteres Anwendungsfeld ist die Überwachung der Protein- und Enzymproduktion in fermentativen Prozessen. Verwendet man dabei FbFP-Proteine zur Expressionsüberwachung (Monitoring) in Verbindung mit einer lineprozesskontrolle wie z.?B. mit einem BioLector-Gerät (Fa. m2p-labs, Aachen), kann die Expressionsrate der FbFPs in Echtzeit verfolgt werden [9,10]. Auch Produktionsprozesse mit neuen, anaeroben Mikroorganismen können so etabliert und optimiert werden.
Die Düsseldorfer Firma evocatal hat in Zusammenarbeit mit der Heinrich-Heine-Universität seit der Entdeckung der FbFP-Marker [5] kontinuierlich an der Weiterentwicklung dieser molekularen Werkzeuge gearbeitet. So wurden eine Reihe rekombinanter Plasmide entwickelt, die Biomedizinern und Biotechnologen den Einsatz der Fluoreszenzmarker zur Erzeugung transkriptionaler Fusionen (fusion kit) oder zur Verwendung in Expressions-studien (express kit) erleichtern. Auch wird fortlaufend an weiteren FbFP-Varianten gearbeitet, die für den Einsatz in verschiedenen Organismen geeignet sind [8].
Dabei erwies sich die Zusammenarbeit zwischen Forschung und Biotech-Industrie bisher als äußerst erfolgreich und wird so auch in Zukunft dazu beitragen, helles Licht ins anaer- obe Dunkel zu bringen.

Abbildung: Dreidimensionale Struktur des FMN-basierten Fluoreszenzproteins EcFbFP.
Die Struktur des blau-grün fluoreszierenden Proteins EcFbFP besteht aus fünf antiparallelen Beta-Faltblättern und vier Alpha-Helices. Das Chromophor FMN befindet sich im Zentrum des Proteins. Die dargestellte Struktur ist von der LOV-Struktur des Blaulichtrezepors YtvA abgeleitet (PDB: 2pr5, [11]).

Literatur
[1] Chudakov, D.M. et al. [2005] Trends Biotechnol. 23, 605-613
[2] Giepmans, B.N.G. et al. [2006] Science 312, 217-224
[3] Matz, M.V. et al. [2002] BioEssays 24, 953-959
[4] Tsien, R.Y. [1998] Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544
[5] Drepper, T. et al. [2007] Nat. Biotechnol. 25, 443-445
[6] Eggert, T. et al. [2005] Patent Number DE102005048828-A1
[7] Losi, A. [2004] Photochem. Photobiol. Sci. 3, 566-574
[8] Tielker D. et al. [2009] Eukaryot. Cell 8, 913-915
[9] Kensy, F. et al. [2009] Microbial Cell Factories 8, 31
[10] Huber, R. et al. [2009] Microbial Cell Factories 8, 42
[11] Möglich, A. & Moffat, K. [2007] J. Mol. Biol. 373, 112-126