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Forensik auf Zellebene

Die Rolle der Laser-Mikrodissektion

von Dr. Antje Plaschke-Schluetter

Professor Alec Jeffries entwickelte 1984 an der Universität von Leicester das Verfahren des genetischen Fingerabdrucks, der heute in vielen Bereichen eine wichtige Rolle spielt. Aber nirgendwo sonst ist er so wichtig wie im Kampf gegen die Kriminalität. Dank neuester Entwicklungen kann diese Technikmittlerweile sogar allein auf Zellebene angewandt werden. In manchen Situationen jedoch stellt die Gewinnung einer sauberen Probe aus einer Unmenge an Zellen – sowohl vom Verdächtigen als auch vom Opfer – die Forensik vor große Herausforderungen. Hier kommt heute die moderne Laser-Mikrodissektion (LMD) zum Einsatz. Mit ihrer Hilfe ist es möglich, die gewünschten Zellen leicht, sicher und kontaminationsfrei für Downstream- Analysen zu extrahieren. Darüber hinaus können männliche und weibliche Zellen dank neuer Zellidentifikationsprozesse mittels Fluoreszenz leicht erkannt und per LMD ausgeschnitten werden.

Zellen, die Bände sprechen!

Alleine aufgrund ihrer Form sind Spermazellen wahrscheinlich die am leichtesten zu identifizierenden Zellen. Sie jedoch aus einer Probe mit einem Gemisch an Zellen zu gewinnen, erfordert in der Regeleine ganze Reihe verschiedener Isolations-bzw. Reinigungsschritte. Darüber hinaus ist deren vollständige Abtrennung und Anreicherung von dem Mischungsverhältnis der Spermien zu anderen vorhandenen Zellen in dem Ausgangsmaterialabhängig. Bei ungünstigen Mischungsverhältnissen ist die Erstellung eines DNA Profils für Spermien oftmals nicht möglich. Daher fehlte in der Vergangenheit in vielen Verfahren das nötige DNA-Beweismaterial, das zu einer Verurteilung hätte führen können.
Dank Laser-Microdissektion konnte diese Lücke in der Forensik geschlossen werden. Denn jetzt lassen sich mithilfe des leistungsstarken UV-Festkörperlasers(355 nm) ausgewählte Zielbereiche punktgenau ausschneiden. Die Pikosekunden- Impulse und die präzise Optik erzielen einen Strahlenpunkt von weniger als 1 ? mund bieten somit eine außergewöhnliche Schnittgenauigkeit. Das wiederum ermöglicht die direkte Extraktion von Spermazellen. Selbst geringe Mengen oder zahlenmäßigungünstige Verhältnisse stellen so kein Problem mehr dar. Heute ist bekannt, dass nur 30–50 gewonnene Spermazellen für ein vollständiges genetisches Profil ausreichen [1]. Das hat auch dazugeführt, dass bisher unlösbare Fälle wieder aufgenommen und Urteile gefällt werden konnten.

Laser-Mikrodissektion

Laser-Mikrodissektionssysteme, wie zum Beispiel das Olympus CellCut Plus, lassen in puncto Flexibilität nichts zu wünschen übrig. Denn sie basieren auf Mikroskopen für den Forschungsbereich und können Zellen sowohl aus getrockneten Proben als auch aus flüssigen Kulturen ausschneiden. Darüber hinaus lassen sich Zellen über gängige Hellfeld-Kontrastfärbung mit Gill’s Hämalaun, Hämatoxylin-Eosin(HE) und Sperma- Antikörpern oder über Fluoreszenzmarkierung – wie zum Beispiel Acridinorange – leicht identifizieren. Mittels vordefinierter Formen oder auch in einem Freihandmodus kann der Anwenderbeliebig viele Zellen, die für die Mikrodissektion von Interesse sind, auf dem Bildschirm markieren. Anschließend übernimmt die Software die Führung und schneidet die identifizierten Zielbereiche automatisch mit dem Laser aus. Entscheidend beim Isolierungsprinzip des CellCut Plus ist die kontaktfreie Gewinnung der dissektierten Zielbereiche mit Hilfe des vollautomatischen CapLift-Systems. In Verbindung mit den neuen Softwareoptionen lässt diese Methode das Aufnehmen von mehreren Proben auf dieselbe Deckelinnenseite eines CapLift-Microtubes in ein definiertes und damit nachvollziehbares Layout zu. Dort können sie nach der Mikrodissektion untersucht und beweisfähig dokumentiert werden. Das Systemist außerdem erweiterungsfähig, sodass eine automatische Probengewinnung von bis zu drei Objektträgern auf acht CapLift-Microtubes durchführbar ist. Aufgrund der kontaminationsfreien Gewinnung von mehreren Zielbereichen ist die LMD für immer mehr forensische Isolierungen eine erste Wahl.

Männlich und weiblich unterscheiden

Mit der Einführung von Protokollen für die geschlechtsspezifische Isolation von diploiden Zellen, die durch herkömmliche Färbemethoden und morphologische Eigenschaften nicht voneinander unterschieden werden können, wurde kürzlich eine weitere Lücke in der Forensik geschlossen [2].
Erste Ansätze bei der geschlechtsspezifischen Differenzierung konzentrierten sich auf solche Detektionsverfahren, bei denen das Y-Chromosom durch Hybridisierung an Digoxygenin markierte Sondensichtbar gemacht wurde. Bei dieser verhältnismäßig einfachen Methode wird die markierte Probe zunächst hybridisiert und anschließend zum Nachweis mit einem sekundären, enzymgebundenen Antikörper und einem korrespondierenden chromogenen Substrat behandelt. Infolgedessen färben sich männliche Zellenviolett, da nur sie Y-Chromosomen enthalten. In Verbindung mit der LMD lassen sich so einzelne männliche Zellen aus einem Gemisch mit vielen weiblichen Zellen isolieren. Umgekehrt kann die Isolierung von einzelnen weiblichen Zellen aus einer Mischung mit vielen männlichen Zellen jedoch genauso relevant sein. Heutzutage stehen für den Nachweis der Geschlechtschromosomen in diploiden Zellen eine Reihe von kommerziell erhältlichen und mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte X/Y-Sonden zur Verfügung, wie zum Beispiel die Sonden der Firma Vysis. Unterschiedliche Fluoreszenzsignale für männliche und weibliche Zellen werden durch die Hybridisierung mit Spektrum Grün markierten Y-Chromosom - Sondenan die Y-Chromosomen und mit Spektrum Orange markierten Sonden an die X-Chromosomen erhalten. Hieraus resultieren zwei rote Signale für die weiblichen Zellen, während die männlichen Zellen je ein grünes und ein rotes Signal aufweisen. Auch hier lassen sich wiederum mit Hilfe der LMD die gewünschten Zielbereiche schnell und sauber für weitere Downstream-Analysen [2] isolieren. Dies könnte zum Beispiel bei einer Mischspur bestehend aus Blutzellen einer männlichen und einer weiblichen Person, die morphologisch nicht voneinander unterschieden werden können, von Bedeutung sein. Darüber hinaus erlaubt die Laser-Mikrodissektion von geschlechtsspezifischen diploiden Zellen auch die Untersuchung von solchen Sexualdelikten, bei denen der Täter keine Spermien im Ejakulat hatte, was bei vasektomierten Tätern der Fall ist oder bei vorliegender Azoospermie.

Weitere Einsatzmöglichkeiten der Laser-Mikrodissektion

Haarproben sind für forensische Ermittlungen von großer Bedeutung und können mehr Hinweise liefern als bisherangenommen. Wichtig sind neben der mikroskopischen Untersuchungen der Haarstruktur, einschließlich Dickemessungen und Querschnitte auch die Isolierung der DNA aus noch vorhandenen Zellkernen an der Haarwurzel. Hier ermöglicht die Laser-Mikrodissektion kontaktfreies Abtrennen von Haarwurzeln. Am Tatort werden viele Proben überspezielle Klebebänder gesichert. Mit der Laser-Mikrodissektion können möglicherweise anhaftende Zellen oder Zelltrümmerdirekt vom Klebeband isoliert und gewonnen werden, was die Laser-Mikrodissektion zu einem essenziellen Werkzeugin allen modernen forensischen Laborenmacht.

Schlussfolgerungen

Durch den Einzug von neuen Instrumenten und Protokollen werden forensische Ermittlungen immer unanfechtbarer. In vielen Situationen, in denen molekulares Beweismaterial existiert, das mit den herkömmlichen Methoden nicht isoliert werden kann, hat die Laser-Mikrodissektion bewiesen, dass sie das Zielmaterial in einem sauberen und verwendbaren Formatliefern kann. Bei alten, ungeklärten Fällen, in denen Indizien erneut untersucht wurden und Probenmaterial erfolgreich für eine DNA-Analyse gewonnen werden konnte, sind die Verurteilungen von Tätern Beweis genug für die Wirksamkeit dieses neuen Werkzeugs.

www.olympus.de

Foto: © Dr. Antje Plaschke-Schluetter

Referenzen
[1] Elliot, K. et al., Forensic Sci. Int. 137 (2003)
[2] Anslinger, K. et al., J Leg Med (2007)