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Analyse bakterieller Infektionserreger

Die schnelle und vor allem zuverlässige Identifizierung von mikrobiellen Pathogenen spielt heute in verschiedenen Bereichen, nicht zuletzt in der klinischen Routineanalytik, eine entscheidende Rolle. Während die klassischen Methoden, welche morpho- logische und biochemische Charakteristika untersuchen, noch heute in der Routineanalytik dominieren, haben sich moderne molekularbiologische Methoden bisher nicht auf breiter Front durchgesetzt. Dies könnte sich nun mit einem vielversprechendem System ändern.

Ein molekularer Fingerabdruck

Eine neue Alternative, welche die hohe Analysegeschwindigkeit und Verlässlichkeit einer molekularen Methode mit einfacher Handhabung verbindet, stellt der MALDI BioTyper dar. Dabei wird, ausgehend von einer Reinkultur, ein charakteristischer molekularer Fingerabdruck eines Mikroorganismus erzeugt. Etwas Probenmaterial (z.B. eine isolierte Kolonie) wird direkt oder nach einem kurzen Extraktionsprotokoll auf einen Probenträger aufgebracht. Anschließend werden die Zellen mit der für den Messprozess notwendigen Matrix, einer organischen Säure, welche die Ionisierung des Analyten bei der Messung bewirkt, überschichtet. Nach Detektion eines Massenspektrums wird der charakteristische Massen-Fingerabdruck, vorwiegend von reich vorhandenen Peptiden und Proteinen, in weniger als einer Minute je Probe aufgenommen. Das Profilspektrum wird mit einer Referenzdatenbank relevanter Mikroorganismen-Profile verglichen und der Organismus anhand der Übereinstimmung der gespeicherten Referenzen mit dem unbekannten Isolat bestimmt.

Zeitvorteil bei der Bestimmung der Antibiotika-Reaktivität

Die MALDI-TOF-basierte Identifikation von Mikroorganismen ist aber nicht nur sehr schnell, zugleich kann unter Verwendung des Extraktionsprotokolls nur ein einziger Arbeitsablauf sowohl für Bakterien (gram negativ und positiv) als auch für Hefen und Pilze verwendet werden. Zusätzliche Prüfungen wie Koagulase oder Oxidase-Tests entfallen und erlauben somit eine effektive Gestaltung der Arbeitsabläufe im Labor. Somit kann je nach vorhandener Laborinfrastruktur und verwendeter Gerätetechnologie für die Ermittlung einer genauen Antibiotika-Suszeptibilität die Zeit bis zur Erstellung eines Antibiogramms um 24 h und mehr verkürzt werden. Zudem zeigt die tägliche Praxis, dass oft durch Kombination von Spezies- Bestimmung und Resistenzlage des Isolationsortes bereits ein erster Therapievorschlag gegeben werden kann.

Im Praxistest : die Valdierungsstudie

Um die Eignung der Methode bei der Bestimmung klinischer Isolate zu testen, wurden in einer Validierungsstudie 575 bakterielle Isolate parallel zur diagnostischen Routine gemessen und anhand ihrer massenspektrometrischen Profile identifiziert (siehe Ablaufschema in Abb. 1). Dazu wurden die Bakterien nach der Über-Nacht-Kultur frisch von Agarplatten geerntet und durch Zugabe von Ethanol zum einen inaktiviert, zum anderen fixiert, sodass sie über Wochen hinweg aufbewahrt und verschickt werden konnten. Nach Aufnahme der Proben in 70 % Ameisensäure und Acetonitril und Sedimentierung wurde 1 ?l des Überstandes, welcher den bakteriellen Extrakt enthielt, auf einen MALDI Probenträger pipettiert. Nach Zugabe der Matrix-Lösung erfolgte die Messung der Profil-Massenspektren der Bakterien im MALDI-TOF Massenspektrometer (microflex™ LT, Bruker Daltonik GmbH). Diese Spektren wurden mittels der MALDI BioTyper™ (Bruker Daltonik GmbH) Software mit einer Referenzdatenbank klinisch relevanter Mikroorganismen verglichen. Die Spezies wird anhand des ermittelten Ähnlichkeits-Scores bestimmt. In Abb. 2 ist ein Identifikationsresultat exemplarisch dargestellt. Für einen Probenträger mit 96 zu analysierenden Proben konnte so die Identifikation in weniger als drei Stunden, von der kultivierten Probe bis zum Ergebnis, durchgeführt werden.

Präzisere Spezies-Identifikation

Der Vergleich der Identifikationsergebnisse mit der parallel durchgeführten Routinebestimmung durch biochemische Tests ist in Abb. 3 dargestellt. Zusammenfassend konnten mit einer Datenbank – Stand Dezember 2006 –, die monatlich im Durchschnitt um ca. 200 Spektren neuer Stämme erweitert wird, 98,8 % der 575 klinischen Isolate mit der MALDI BioTyper Methodik korrekt identifiziert werden. Dabei stimmte bei 90,7 % der Proben das Ergebnis beider Methoden überein, wobei der MALDI BioTyper jedoch bei 40 % sogar eine Identifikation der Spezies ermöglichte, die durch biochemische Tests nur auf Gattungsebene bestimmt werden konnten. Bei 2,4 % der Proben konnte durch die Massenspektrometrie eine Mischkultur von mindestens zwei Erregern nachgewiesen werden, während die Routine hier nur den biochemisch dominanten Keim ermittelte. Bei 5,7 % der Proben ergab die MALDI Analyse eine abweichende Spezies-Bestimmung. In diesen Fällen wurden die Bakterien erneut mit einer weiteren Methode untersucht (Api System, bio Mérieux; molekulargenetische Charakterisierung), um die Identität zu klären. In der überwiegenden Zahl der Fälle konnte das massenspektrometrische Ergebnis bestätigt werden (32 von 33), nur bei 1 Probe (Klebsiella/Raoultella falsche/unklare Spezies) bestätigte sich das MALDI Resultat nicht. Lediglich 1,2 % der klinischen Isolate konnten mit dem MALDI BioTyper nicht bestimmt werden, da zu dem Zeitpunkt der Analysen kein entsprechender Referenzeintrag in der Vergleichsdatenbank vorhanden war.

Fazit: Hohe Präzision bei schnellem Probendurchsatz

In der vorliegenden Studie zeigte sich, dass das massenspektrometrische Verfahren bei kürzerer Analysezeit eine höhere Genauigkeit bei der Identifikation lieferte als biochemische Methoden. Somit stellt die Identifikation bakterieller Krankheitserreger mit dem MALDI BioTyper eine ausgezeichnete Alternative zu den herkömmlich angewandten Methoden in der klinischen Routine dar. Weitere Infos und eine Application Note „Microorganism Identification and Classification Based on MALDI-TOF MS Fingerprinting with MALDI BioTyper“ sind erhältlich bei Dr. Markus Kostrzewa.

km@bdal.de

Foto: © Dr. Markus Kostrzewa