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pBARN Klonierungsvektoren – positive Selektion von Rekombinanten

Klar im Vorteil

von Dr. Wolfram Marx, Dr. Mario Mehmel

Dr. Wolfram Marx und Dr. Mario Mehmel, AppliChem GmbH

Die BARN-1 und BARN-2 PCR-Blunt-Klonierungssysteme basieren auf der Ausschaltung der Barnase- Genexpression durch die Insertion eines PCR-Fragments in die multiple Klonierungsstelle (multiple cloning site, MCS) der pBARN-Vektoren. Barnase ist eine RNase und toxisch für Bakterien. E.coli-Zellen, die den nichtrekombinanten Vektor aufnehmen, werden direkt nach Expression der Barnase getötet. Dadurch wird die klassische Blau-Weiß-Selektion überflüssig. Im Gegensatz zu anderen positiven Klonierungssystemen sind die BARN-1/-2 - Systeme nicht auf spezielle E.coli-Stämme beschränkt oder auf spezielle Restriktionsschnittstellen für die Ligation des Inserts (blunt Klonierung). Die pBARN-Klonierungsvektoren kombinieren die Vorteile der positiven Klonierungssysteme ohne die bekannten Nachteile der anderen verfügbaren Systeme zu haben.

Abb. 1 Strukturmodell der Barnase von Bacillus amyloliquefaciens (nach Wilton et al. (2009) Biophys. J. 97, 1482-1490). Barnase katalysiert die Spaltung einzelsträngiger RNA mithilfe eines Zwei-Schritt-Mechanismus.

Es geht auch ohne blau-weiß

Viele der heute noch eingesetzten Klonierungsvektoren basieren auf der Blau-Weiß-Selektion zur Identifizierung erfolgreich klonierter Inserts in einen entsprechenden Vektor. Dabei werden DNA-Fragmente wie PCR-Produkte oder Stücke genomischer DNA, in die multiplen Klonierungsstellen (MCS) eines Plasmid-DNAVektors kloniert. Dann werden kompetente E.coli-Zellen transformiert und man lässt sie in Anwesenheit von X-Gal wachsen. Bei erfolgreicher Insertion eines DNA-Fragmentes erscheint die Bakterienkolonie weiß, ansonsten ist sie blaugefärbt. Diese traditionelle Methode wurde in den späten 70er-Jahren entwickelt und ist seither verfeinert und vereinfacht worden. Jedoch birgt diese Methode 2 größere Nachteile: Die Effizienz der Blau-Weiß-Klonierung ist relativ niedrig und die Kosten pro Klonierung sind relativ hoch. Es werden häufig falsch-positive Klone detektiert, die weiterer Analysen bedürfen (subklonieren, analytischer Restriktionsenzymverdau oder sequenzieren). Zur weiteren Erleichterung und vor allem zur Hochdurchsatzklonierung wurden verschiedene positive Klonierungssysteme entwickelt. (Tab. 1).

Tab. 1 Vergleich verschiedener Klonierungssysteme mit positiver Selektion

Das Prinzip der positiven Selektionsklonierung ist eher unkompliziert. Die Insertion eines PCR-Fragmentes in eine MCS eines positiven Selektionsvektors unterbricht die Expression/ Aktivität eines Gens für ein toxisches Genprodukt, das nur das Wachstum von positiven Rekombinanten (bis zu 100 %!) nach Transformation erlaubt. E.coli-Zellen, die nur den religierten Vektor ohne Insert enthalten, werden abgetötet. Nachteile bekannter Klonierungssysteme mit positiver Selektion von Rekombinanten sind: (i) Die Position der MCS mitten in der Sequenz des Gens für das toxische Genprodukt. Dies führt zu Einschränkungen bezüglich der Wahl der Restriktionsenzyme und zur Begrenzung von universellen Sequenzierprimern. (ii) Begrenzung der einsetzbaren bakteriellen Stämme. (iii) Begrenzung der Fragmentgröße des DNA-Inserts. (iv) In manchen Fällen ist die Hantierung umständlich.

Abb. 2 Schematische Darstellung der Klonierung von PCR- Fragmenten mit glatten (blunt) Enden in die Eco RV-Schnittstelle der MCS des pBARNVektors.

Das BARN-PCR-Blunt-Klonierungssystem

Das BARN-PCR-Blunt-Klonierungssystem ist ein einfach anwendbares, schnelles und hoch effizientes positives Klonierungssystem für PCR-Fragmente mit glatten Enden (blunt). Überhänge, die z.B. durch Taq DNA-Polymerase oder andere DNA-Polymerasen ohne „proof-reading“-Funktion entstehen, müssen entsprechend geglättet werden (blunted). Das BARN-PCR-Blunt-Klonierungssystem basiert auf dem toxischen Barnase-Genprodukt, einer kleinen, hochaktiven Ribonuklease aus Bacillus amyloliquefaciens (Yazynin et al. 1996; Yazynin et al., 1999; Abb. 1). Die pBARN-1- und -2-PCRBlunt- Klonierungsvektoren (3,4 kb bzw. 3,2 kb), die Hauptkomponenten des Systems, erlauben die direkte Selektion von Rekombinanten durch die Inaktivierng des letalen Barnase-Gens. Der Vektor enthält das Barnase-Gen unter der Kontrolle des lac-Promotors. Die Barnase weist am N-Terminus eine Fusion mit speziell entworfenen Sequenzen auf, einschließlich der MCS. Die Insertion eines PCR-Fragmentes unterbricht die Expression/Aktivität der Barnase- Fusion, was nur das Wachstum von positiven Rekombinanten nach Transformation erlaubt (Abb. 2). Daher ist das Blau-Weiß-Screening überflüssig. Das BARN-Klonierungssystem erzielt Erfolgsraten von 85–100 % und erlaubt die einfache Analyse der klonierten PCRFragmente. Irgendwelche Aufreinigungen oder Modifikationen von Vektor und Fragment sind nicht erforderlich. BARN-1- und -2-PCRBlunt- Klonierungssysteme können mit allen häufig verwendeten Bakterienstämmen kombiniert werden.

Abb. 3 Karte von pBARN-1- und pBARN-2-PCR-Blunt-Klonierungsvektoren. Die Positionen verschiedener Elemente und der einmaligen Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme sind hervorgehoben.

Kompatible bakterielle Stämme

Das BARN-Klonierungssystem ist mit allen Bakterienstämmen kompatibel, die keinen lac-Repressor exprimieren oder nur in geringer Konzentration. Die unten aufgelisteten E.coli-Stämme sind Beispiele für mit pBARN-1/-2 Klonierungsvektoren verwendbare Stämme. Für die abtötende Wirkung durch Barnase ist normal die basale Aktivität des lac-Promotors in den üblicherweise verwendeten bakteriellen Stämmen ausreichend. In Ausnahmefällen – für E.coli-Stämme mit hohem lac-Repressorgehalt – ist eine IPTG-Stimulation erforderlich. In diesen Fällen haben sich 20 µl einer 0,1 M IPTG-Stammlösung pro Platte als ausreichend erwiesen.

Vorteile von pBARN auf einen Blick

>> Klone ohne Insert werden aktiv eliminiert –
„kill-the-rest approach”
>> keine falsch-positiven Klone
>> Blau-Weiß-Screening nicht erforderlich,
X-Gal und IPTG werden nicht benötigt
>> mit den meisten E.coli-Stämmen kompatibel
>> höchste Effizienz (bis zu 100 % positive Klone)
>> keine Behandlung des PCR-Fragments
>> schnelle Ligation in nur 5 Minuten
>> DNA-Inserts mit einer Größe von bis zu 8 kb möglich
>> flexible Insert/Vektorverhältnisse
>> „frame-shift”-Selektion
>> einfache Analyse der PCR-Fragmente
(T3/SP6- oder T7/SP6-Promotorregionen)
>> geliefert als ready-to-use linearisierte Plasmid-DNA
>> in-vitro-Transkription

Literatur
[1.] Yazynin, S., Deyev, S., Jucivic, M. & Hartley, R.W. (1996) Gene 169(1), 131-132. A plasmid vector with positive selection and directional cloning based on a conditionally lethal gene.

[3.] Wilton, D., Kitahara, R., Akasaka, K., Pandya, M. ,Williamson, M. (2009) Biophys. J. 97(5), 1482-1490. Pressure-Dependent Structure Changes in Barnase on Ligand Binding Reveal Intermediate Rate Fluctuations